分光光度计的原理 光度计工作原理

第第页分光光度计的原理光度计工作原理分光光度计，又称光谱仪（spectrometer），是将成分多而杂的光，分解为光谱线的科学仪器。测量范围一般包括波长范围为380～780nm的可见光区和波长范围为200～380nm的紫外光区。不同的光源都有其特有的发射光谱,因此可接受不同的发光体作为仪器的光源。钨灯的发射光谱:钨灯光源所发出的380～780nm波长的光谱光通过三棱镜折射后，可得到由红、橙、黄、绿、蓝、靛、紫构成的连续色谱；该色谱可作为可见光分光光度计的光源。光度定义分光光度法是在特定波优点或确定波长范围内光的吸取度，对该物质进行定性或定量分析。常用的波长范围为:（1）200～380nm的紫外光区，（2）380～780nm的可见光区，（3）2.5～25m（按波数计为4000cm—1～400cm—1）的红外光区。所用仪器为紫外分光光度计、可见光分光光度计（或比色计）、红外分光光度计或原子吸取分光光度计。为保证测量的精密度和精准度，全部仪器应依照国家计量检定规程或本附录规定，定期进行校正检定。仪器构成分光光度计已经成为现代分子生物试验室常规仪器。常用于核酸，蛋白定量以及细菌生长浓度的定量。

仪器紧要由光源、单色器、样品室、检测器、信号处理器和显示与存储系统构成。原理分光光度计接受一个可以产生多个波长的光源，通过系列分光装置，从而产生特定波长的光源，光线透过测试的样品后，部分光线被吸取，计算样品的吸光值，从而转化成样品的浓度。样品的吸光值与样品的浓度成正比。

单色光辐射穿过被测物质溶液时，被该物质吸取的量与该物质的浓度和液层的厚度（光路长度）成正比，其关系如下式:

A=—lg（I/I。）=—lgT=kLc

式中:A为吸光度；

I。为入射的单色光强度；

I为透射的单色光强度；

T为物质的透射率；

k为摩尔吸取系数；

L为被分析物质的光程，即比色皿的边长；

c为物质的浓度；

物质对光的选择性吸取波长，以及相应的吸取系数是该物质的物理常数。当已知某纯物质在确定条件下的吸取系数后可用同样条件将该供试品配成溶液，测定其吸取度,即可由上式计算出供试品中该物质的含量。在可见光区，除某些物质对光有吸取外，很多物质本身并没有吸取但可在确定条件下加入显色试剂或经过处理使其显色后再测定,故又称比色分析。由于显色时影响呈色深浅的因素较多，且常使用单色光纯度较差的仪器，故测定时应用标准品或对比品同时操作。分光光度计测量条件的选择

1、参比溶液和溶剂的选择

分光光度计的测量实际上是以通过参比池的光强度作为人射光强度来测定试样的吸光度，先调整仪器使透过参比池溶液的吸光度为零，然后让同一束光通过样品，使得吸光度比较真实地反映待测物质的浓度，所以参比溶液的选择特别紧要。

假如仅有待测物质与显色剂的反应产物有吸取，可用纯溶剂或蒸馏水作参比溶液。假如显色剂有颜色，并在测定波长下有吸取，则用显色剂溶液作参比溶液，所加人显色剂及其它试剂的量，与试样中的加入量应一致。

假如样品中其它组分本身的颜色对测定有干扰，而所用显色剂没颜色，则用不加显色剂的样品溶液作参比液。

正确选择合适的溶剂，对提高分析的精准度起紧要作用。为减小溶剂中杂质的影响，应选择高纯度的溶剂；溶剂应不与待测物质发生化学反应；待测物在溶剂中要有确定的溶解度；在测定的波长范围内，溶剂本身没有吸取，注意常用溶剂的最短可用波长；当用挥发性大的溶剂时，测量过程中吸取池应加盖。

2、测试波长的选择

当用分光光度计对溶液进行测定时，首先需要选择合适的测量波长。选择的依据是该被测溶液的吸取曲线。在一般情况下，我们总是选择最大吸取波长作为测量波长，这样可以提高灵敏度，而在有些情况下最大吸取峰很尖锐、吸取过大或相近有干扰存在，就不能选最