HYT 147.3-2013 海洋监测技术规程 第3部分：生物体（正式版）

海洋监测技术规程第3部分：生物体Codeofpracticeformarinemonitoringtech2013-04-25发布I Ⅲ 12规范性引用文件 3术语和定义 14一般规定 15总汞的测定——热分解冷原子吸收光度法 2 57多环芳烃 88酞酸酯类化合物 209有机磷农药的测定——气相色谱法 2810有机锡的测定——气相色谱法 11多溴联苯醚的测定——气相色谱/质谱联用法 附录A(规范性附录)记录表 41附录B(资料性附录)方法检出限 附录C(资料性附录)EROD的测定——动力学荧光法 附录D(资料性附录)海洋生物体内总乙酰胆碱酯酶的测定 图118种PAHs标准溶液GC-MS-SIM谱图 图216种PAHs标准溶液气相色谱图 图3PAHs标准溶液液相色谱图 图46种酞酸酯标准溶液气相色谱/质谱图 24图56种酞酸酯标准溶液气相色谱图 27图614种有机磷农药标准溶液气相色谱图 图7有机锡化合物标准溶液气相色谱图 图8多溴联苯醚标准溶液气相色谱/质谱图 表1自动测汞仪分析条件 3表2微波消解仪工作条件 6表3ICP-MS测定各元素的重复性、再现性及回收率 7表4GC-MS测定PAHs的保留时间与定量离子 表5GC-MS测定PAHs的重复性、再现性及回收率 表6GC-FID测定PAHs的重复性、再现性及回收率 表7HPLC梯度洗脱程序 20Ⅱ表8HPLC测定PAHs的重复性相对标准偏差 20表9GC-MS测定酞酸酯的定量离子参数 24表10GC-MS测定酞酸酯的重复性、再现性及回收率 24表11GC-ECD测定酞酸酯的重复性、再现性及回收率 28表12GC-FPD测定有机磷农药的重复性、再现性及回收率 表13GC-FPD测定有机锡化合物的重复性、再现性及回收率 35表14GC-MS测定多溴联苯醚的保留时间及特征离子 39表15GC-MS测定多溴联苯醚的重复性、再现性及回收率 39表A.1生物体样品汞分析记录表 41表A.2生物体样品中分析记录表 42表A.3生物样品中多环芳烃的内标工作曲线记录表 表A.4生物样品中多环芳烃分析记录表 44表A.5生物样品中多环芳烃工作曲线记录表 45表A.6生物样品中多环芳烃分析记录表 46表A.7生物样品中酞酸酯分析记录表 47表A.8生物样品中酞酸酯标准曲线记录表 48表A.9生物样品中酞酸酯分析记录表 49表A.10生物样品中有机磷农药标准曲线记录表 表A.11生物样品中有机磷农药分析记录表 表A.12生物样品中有机锡化合物分析记录表 表A.13生物样品中多溴联苯醚分析记录表 表B.1测定方法检出限 54表C.1EROD现场采样记录表 表C.2EROD分析记录表 60表D.1AchE现场采样记录表 63表D.2AchE分析记录表 Ⅲ——第1部分：海水；——第2部分：沉积物；——第3部分：生物体；——第4部分：海洋大气；——第5部分：海洋生态；——第6部分：海洋水文、气象与海冰；——第7部分：卫星遥感技术方法。本部分为HY/T147的第3部分。本部分按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本部分由国家海洋环境监测中心提出。本部分由全国海洋标准化技术委员会(SAC/TC283)归口。本部分负责起草单位：国家海洋环境监测中心。本部分参与起草单位：国家海洋局南海环境监测中心、国家海洋局东海环境监测中心、国家海洋局北海环境监测中心。1海洋监测技术规程第3部分：生物体HY/T147的本部分规定了鱼、虾、贝类等海洋生物体监测项目的分析方法。本部分适用于远海、近海及河口海洋生物的监测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6379.2—2004测量方法与结果的准确度(正确度与精密度)第2部分：确定标准测量方法重复性与再现性的基本方法GB17378.1海洋监测规范第1部分：总则GB17378.2海洋监测规范第2部分：数据处理与分析质量控制GB17378.3海洋监测规范第3部分：样品采集、贮存与运输GB17378.6海洋监测规范第6部分：生物体分析3术语和定义GB17378.1和GB17378.2界定的以及下列术语和定义适用于本文件。海洋生物样品marinebiologicalsample冷冻干燥freeze-drying将待干燥物快速冻结后，再在高真空条件下将其中的冰升华为水蒸气而去除的干燥方法。由于冰的升华带走热量使冻干整个过程保持低温冻结状态，有利于保留一些生物样品(如蛋白质)的活性。4一般规定4.1样品采集4.2试剂和材料本部分实验用品应按下述要求处理：2c)试剂、有机溶剂按测项具体分析方法的要求进行纯化；d)所用试剂和溶剂宜是同一厂家生产的同类产品；e)为保证实验的重现性和再现性，重蒸馏有机试剂应混匀，实验条件应一致。4.3实验室常规设备实验室常用仪器与设备如下：b)冰柜；c)电加热板(或电炉);d)分析天平；e)高精度电子天平(感量为0.1mg);h)马弗炉；i)超纯水系统；j)亚沸蒸馏器：k)离心机；1)真空抽滤泵；n)生物组织研磨机；o)冷冻干燥机。4.4质量保证与质量控制质量保证与质量控制措施包括：a)样品测定过程中应加测现场空白样；b)现场平行样：现场平行样应占样品总量的5%～10%,每次采样至少采两组平行样；c)设备材料空白：当使用新采样设备、新容器和新材料时，应进行设备材料的空白试验；d)分析空白应占样品总数的5%,样品少于20个时，每批至少带一个分析空白；e)每批样品应按样品总数的2%(样品不足10个时，应至少做2个)做加标回收率的测定；f)当样品量超过20个时，应进行平行三份样品的分析；g)质控样的测定值和加标回收率超出控制线时，应查找原因，在未找出原因之前不得继续分析样品。4.5精密度与正确度精密度与正确度的测定和计算按照GB/T6379.2—2004的规定执行。5总汞的测定——热分解冷原子吸收光度法5.1适用范围本方法适用于远海、近海及河口海洋生物样品中总汞的测定。方法检出限参见表B.1。35.2方法原理在热分解管中，样品被充分干燥后经热分解释放其中的汞，产生的气体被载气导入催化炉，完成氧化作用并脱去卤素、硫氧化物和氮氧化物后进入混汞器，发生汞齐化反应被固定。混汞器加热释放出汞蒸汽，并由载气载入吸收池，在波长253.7nm处测定。5.3试剂及其配制5.3.1除非另有说明，所用试剂均为优级纯，水为二次蒸馏水或超纯水或纯度相当的水。5.3.2氯化汞(HgCl₂):预先在硫酸干燥器中干燥。5.3.3硝酸溶液(1+19):移取50mL硝酸(HNO₃,p=1.42g/mL)加入到950mL水中。5.3.4硝酸溶液(1+199):移取5mL硝酸(HNO₃,p=1.42g/mL)加入到995mL水中。5.3.5汞标准贮备溶液(1.00mg/mL,以汞计):称取0.1354g氯化汞(5.3.2)于100mL烧杯中，用少许硝酸溶液(5.3.3)溶解，全量转入100mL容量瓶中，加硝酸溶液(5.3.3)定容至标线，混匀。盛于棕色硼硅玻璃试剂瓶中。5.3.6汞标准中间溶液(10.00mg/L,以汞计):移取1.00mL汞标准贮备溶液(5.3.5)于100mL的5.3.7汞标准使用溶液(1.00mg/L,以汞计):量取10.00mL汞标准中间溶液(5.3.6)于100mL的容量瓶中，加硝酸溶液(5.3.3)定容至标线，混匀。此溶液使用前配制。5.4仪器及设备5.4.2载气：氧气(纯度99.99%)。5.4.4电子天平：感量为0.1mg。5.4.6棕色硼硅玻璃试剂瓶。5.4.7实验室常用仪器及设备。5.5分析步骤5.5.1自动测汞仪工作条件仪器分析条件宜按照表1进行设定。表1自动测汞仪分析条件干燥时间℃消解时间S消解温度℃如果分析结果的相对标准偏差超过5%,则消解时间需要增加30s重新分析，再计算标准偏差。”重量以mg计。4取7个100mL容量瓶，分别加入0mL、0.20mL、0.50mL、1.00mL、5.00mL、10.00mL、20.00mL汞标准使用溶液(5.3.7),加硝酸溶液(5.3.4)定容至标线，混匀。配液的吸光值A;,以吸光值(A;—Ao)为纵坐标，汞的量为横坐标绘制标准曲线(给出线性回归方程)并计5.5.3.3样品测定将样品吸光值A。和空白吸光值A₀的测定结果记入表A.1中，以标准系列溶液的含量为纵坐标， (1)四家实验室测定同一生物样品，重复性相对标准偏差为1.78%、再现性相对标准偏差为2.42%,回收率为95%～102%。56.1适用范围法检出限参见表B.1。6.2方法原理样品经消解后所得到的酸性消化液经由蠕动泵提升进入ICP-MS,样品雾化后以气溶胶的形式进入等离子体区域，经过蒸发、解离、原子化、电离等过程，转化为带正电荷的离子后被导入高真空的质谱部分，待测离子经质量分析器按质荷比(m/z)的大小过滤分离后进入离子检测器，根据离子强度的大小计算得到样品中待测元素的浓度。6.3试剂及其配制6.3.1除非另有说明，所用试剂均为优级纯，水为去离子水或超纯水或纯度相当的水。6.3.2硝酸(HNO₃):p=1.426.3.3过氧化氢(H₂O₂):30%。6.3.4硝酸溶液(1+99):1mL硝酸(6.3.2)与99mL水混合。6.3.5硝酸溶液(1+1):硝酸(6.3.2)与等体积水混合。6.3.6多元素混合调谐溶液(1.00pg/L):Li、Co、8°Y、37Ba、140Ce、05Tl等元素的浓度均为1.00pg/L的多元素混合调谐溶液。单元素或多元素标准贮备溶液，溶剂为硝酸溶液。6.3.8标准中间溶液(1.000mg/L):移取10.00mL标准贮备溶液(6.3.7)于100mL容量瓶中，用硝酸溶液(6.3.5)定容，4℃冷藏保存，有效期1个月。6.3.9标准使用溶液(0.1000mg/L):移取10.00mL标准中间溶液(6.3.8)于100mL容量瓶中，用硝酸溶液(6.3.5)定容，4℃冷藏保存，临用前配置。每种元素浓度均为10.0mg/L的内标溶液。6.4仪器设备6.4.1电感耦合等离子体质谱仪(ICP-MS),主要由下述各部分组成：——样品引入系统，等离子气体为氩气(纯度为99.999%);——ICP离子源；——接口及离子聚焦系统；——质量分析器；——检测器。警告——使用ICP离子源时，注意防护高频辐射。6.4.2微波消解仪。6.4.3具盖聚四氟乙烯坩埚。6.4.4微波消解罐。6.4.5实验室常用仪器与设备。66.5分析步骤6.5.1样品消解生物样品消解方法有电热板消解和微波消解，可按实验室条件任选一种。具体方法如下：a)电热板消解：称取1.000g生物组织湿样(或0.2000g生物组织干样)于聚四氟乙烯坩埚中，用少量水润湿，加入5mL硝酸(6.3.2),盖上盖子后于室温下静置24h。将坩埚移至电热板上，逐渐升温至180℃消化2h～3h,取下待冷却后，加入2mL硝酸(6.3.2)和2mL过氧化氢(6.3.3),盖上盖子，置于电热板上180℃消化3h～5h,冷却后，打开盖子，140℃加热蒸至近干，加1mL硝酸溶液(6.3.5),微热浸提，用水将浸提液及残渣全量转入25mL比色管中，用水定容至标线，静置后取上清液待测。b)微波消解：称取1.000g生物组织湿样(或0.2000g生物组织干样)于微波消解罐中，加少许水润湿，加入8mL硝酸(6.3.2),2mL过氧化氢(6.3.3),待反应平稳后，旋紧瓶盖，放入微波消解仪中，参照表2进行消解，消解完毕待冷却至室温后取出。小心拧下盖子后，将消解罐置于赶酸装置上，加热赶酸；若没有相应的赶酸装置，将消解液全量转移至聚四氟乙烯坩埚中，置于电热板上加热，至溶液近干时，加1mL硝酸溶液(6.3.5),微热浸提，用水将溶液及残渣全量转入25mL比色管中，用水定容至标线，混匀后静置，取上清液待测。表2微波消解仪工作条件W升温时间温度℃保持时间66266.5.2仪器工作条件优化仪器运行稳定后，引入多元素混合调谐溶液(6.3.6)调节仪器的各项参数，选择低、中、高质量数元素对仪器的灵敏度进行调谐，同时应调节氧化物以及双电荷等指标至满足测定要求。6.5.3绘制标准曲线取8个100mL容量瓶，用微量移液器或移液管，分别加入0mL、0.050mL、0.100mL、0.50mL、1.00mL、2.00mL、5.00mL、10.0mL标准使用溶液(6.3.9),用硝酸溶液(6.3.4)定容至标线，配制的20.0ng/mL、50.0ng/mL、100ng/mL。按仪器设定的条件对标准系列溶液进行测定，绘制标准曲线。6.5.4样品测定按仪器设定的条件直接测定空白溶液和样品消解溶液，测定值分别为X。和X;。6.6记录与计算用标准曲线的线性回归方程计算生物样品消解溶液中各元素的浓度值，按式(2)计算生物样品中待测元素的含量。测试结果记入表A.2中。7%%回收率%铜锌铅镉铬铝锰铁镍砷87多环芳烃警告——本实验操作过程中需接触大量有机溶剂，且标准物质或溶液均具有高毒性，因此实验应在通风橱内进行。7.1多环芳烃的测定——气相色谱/质谱联用法7.1.1适用范围苯并[b]荧蒽、苯并[k]荧蒽、苯并[a]芘、茚并[1,2,多环芳烃(PAHs)的测定。方法检出限参见表B.1。7.1.2方法原理生物样品中的PAHs,用正己烷与二氯甲烷的混合溶液作提取液，用索氏提取法(或超声提取法或加速溶剂萃取法)对生物体中的PAHs进行提取，提取液经浓缩净化后，用气相色谱/质谱联用仪测定。7.1.3试剂及其配制7.1.3.1除非另有说明，所用试剂均为色谱纯，有机溶剂浓缩300倍不得检出PAHs。水为正己烷充分洗涤过的蒸馏水或超纯水或相当纯度的水。7.1.3.2硅藻土。7.1.3.3正己烷(C₆H₁₄)。7.1.3.4异辛烷(CgH₁g)。7.1.3.5二氯甲烷(CH₂Cl₂)。7.1.3.7二氯甲烷/正己烷混合溶液(1+1):将等体积的二氯甲烷(7.1.3.5)与正己烷(7.1.3.3)混合均匀。7.1.3.8二氯甲烷/正己烷混合溶液(2+3):二氯甲烷与正己烷以体积比为2:3的比例均匀混合。7.1.3.9无水硫酸钠(Na₂SO₄):分析纯，550℃烘8h,冷却后装瓶，干燥器中密封保存。7.1.3.10中性氧化铝(Al₂O₃):100目～200目(149μm～74μm),550℃烘8h,于磨口玻璃瓶中冷却至室温，每100g加3mL水，充分混匀，干燥器内7.1.3.11硅胶：120目～200目(124μm～74μm),550℃烘8h,干燥器内保存。并[a]蒽、施、苯并[b]荧蒽、苯并[k]荧蒽、苯并[a[g,h,i]花等浓度均为2000mg/L的PAHs标准溶液，4℃避光保存。7.1.3.13替代标准溶液(2000mg/L):萘-d8、范-d10、菲-d10、蔗-d12和二萘嵌苯-d12等浓度均为7.1.3.14内标物标准溶液(2000mg/L):三联苯-d14浓度为2000mg/L的内标物标准溶液，4℃避7.1.3.15PAHs标准贮备溶液(100.0mg/L):准确移取500μLPAHs标准溶液(7.1.3.12)至10mL容量瓶中，用正己烷定容。4℃避光保存，有效期1年。7.1.3.16替代标准贮备溶液(100.0mg/L):准确移取500μL替代标准溶液(7.1.3.13)至10mL容量瓶中，用正己烷定容。4℃避光保存，有效期1年。97.1.3.17内标物标准贮备溶液(100.0mg/L):准确移取500μL内标物标准溶液(7.1.3.14)至10mL容量瓶中，用正己烷定容。4℃避光保存，有效期1年。7.1.3.18PAHs标准使用溶液(10.0mg/L):准确移取1.00mLPAHs标准贮备溶液(7.1.3.15)至10mL容量瓶中，用正己烷或异辛烷(7.1.3.4)定容，4℃避光保存，有效期6个月。7.1.3.19替代标准使用溶液(10.0mg/L):准确移取1.00mL替代标准贮备溶液(7.1.3.16)至10mL容量瓶中，用正己烷或异辛烷定容，4℃避光保存，有效期6个月。7.1.3.20内标物标准使用溶液(10.0mg/L):准确移取1.00mL内标物标准贮备溶液(7.1.3.17)至10mL容量瓶中标准用正己烷或异辛烷定容，4℃避光保存，有效期6个月。7.1.4仪器与设备7.1.4.1气相色谱/质谱仪(GC-MS)。0.25mm,固定相液膜厚度0.25μm。7.1.4.3加速溶剂萃取仪，附萃取池。7.1.4.4超声萃取仪。7.1.4.5索氏提取器。7.1.4.6玻璃层析柱：长400mm,内径10mm。7.1.4.7旋转蒸发装置。7.1.4.8实验室常用仪器与设备。7.1.5分析步骤7.1.5.1样品提取生物样品按下述三种方法中的任一种进行提取：a)索氏提取法：称取2.000g～3.000g生物干样和2g无水硫酸钠(7.1.3.9),混匀，置于索氏提取器套筒内，加入100mL二氯甲烷/正己烷混合溶液(7.1.3.7),加入40μL替代标准使用溶液(7.1.3.19),浸泡12h后，于50℃水浴中回流提取8h。提取液转移至旋转蒸发瓶中，用20mL二氯甲烷冲洗索氏提取器2次，合并冲洗液于旋转蒸发瓶中，浓缩至1mL,待净化；b)超声提取法：称取2.000g～3.000g生物干样和2g无水硫酸钠，混匀，置于预先用正己烷浸泡过的圆形滤纸筒内，放入100mL具塞比色管内，加入60mL二氯甲烷/正己烷混合溶液(7.1.3.7),加入40μL替代标准使用溶液，浸泡12h后，超声提取20min,静置5min,将提取液转移至旋转蒸发瓶中，用20mL二氯甲烷重复超声提取2次，合并冲洗液于旋转蒸发瓶中，浓缩至2mL,待净化；c)加速溶剂萃取法：称取2.000g～3.000g生物干样和1g硅藻土(7.1.3.2),加入40μL替代标准使用溶液，混匀，放入萃取池中，按下述条件萃取，萃取液转移至旋转蒸发瓶中，浓缩至加速溶剂萃取仪宜采用以下萃取条件：——萃取溶剂：正己烷和二氯甲烷，体积比为1:1;——萃取温度：100℃; 压力：1000psi～1500psi(6.9×10⁶Pa～10.3×10⁶Pa):——静态萃取时间：5min;——循环次数：2次；——洗脱体积：60%;硫酸钠依次加入层析柱中，用40mL正己烷以2mL/min的流量淋洗柱子，弃去淋洗液。全量转移样品提取液于层析柱上，用80mL二氯甲烷/正己烷混合溶液(7.1.3.8),以2mL/min的流速淋洗层析用溶液(7.1.3.18),再向上述容量瓶中各加入400μL内标物标准使用溶液(7.1.3.20),用异辛烷——升温程序：初温50℃,以4℃/min的速度升至220℃,保持3min;以10℃/min的速度升至通过比较样品与标准溶液的色谱峰的保留时间进行目标化合物的定性。可参考图1和表4进行7.1.7.2定量分析五家实验室测定同一生物样品，重复性相对标准偏差、再现性相对标准偏差及回收率参见表5。本部分操作过程中应注意如下事项：——实验中所用器皿，使用前用正己烷冲洗；——实验中所用试剂，使用前做空白检验。1——萘；2——二甲基萘；3——一甲基萘；4——二氢范；5——范；6——芴；7——菲；8——蒽；12——蕊；13——苯并[b]荧蒽；14——苯并[k]荧蒽；15——苯并[a]芘；16——茚并[1,2,3-c,d]芘；保留时间1萘234二氢范5范6芴表4(续)保留时间7菲8蒽9荧蒽芘苯并[a]蒽蔗苯并[b]荧蒽苯并[k]荧蒽二苯并[a,h]蒽范-d10菲-d10%%回收率%1萘234二氢范5范6芴7菲8蒽9荧蒽芘苯并[a]蒽%%回收率%蕊苯并[b]荧蒽苯并[k]荧蒽二苯并[a,h]蒽苯并[g,h,i]花7.2多环芳烃的测定——气相色谱法7.2.1适用范围[k]荧蒽、苯并[a]芘、苯并[g,h,i]花、二苯并测定。方法检出限参见表B.1。用索氏提取法(或超声提取法或加速溶剂萃取法)提取生物体中的多环芳烃于正己烷中，用硅胶/氧7.2.3试剂及其配制7.2.3.1除非另有说明，所用试剂均为色谱纯。水为正己烷充分洗涤过的蒸馏水或超纯水或相当纯度的水。7.2.3.2硅藻土。7.2.3.3正己烷(C₆H₁₄)。7.2.3.4二氯甲烷(CH₂Cl₂)。7.2.3.5二氯甲烷/正己烷(1+1)混合溶液：等体积的二氯甲烷(7.2.3.4)与正己烷(7.2.3.3)均匀混合。7.2.3.6二氯甲烷/正己烷(2+3)混合溶液：200mL的二氯甲烷(7.2.3.4)与300mL的正己烷均匀混合。7.2.3.7无水硫酸钠(Na₂SO₄):分析纯，550℃烘8h,冷却后装瓶，干燥器中密封保存。7.2.3.8中性氧化铝(Al₂O₃):100目～200目(149μm～74μm),550℃加热8h,于封口玻璃瓶中冷却至室温，每100g加入3mL水，振荡混匀，干燥器内保存(平衡2h以上方可使用)。7.2.3.9硅胶：120目～200目(124μm～74μm),550℃烘8h,干燥器内保存。[g,h,i]花等浓度为2000mg/L的PAHs标准溶液，4℃避光保存。7.2.3.11PAHs标准贮备溶液(100.0mg/L):准确移取500μLPAHs标准溶液(7.2.3.10)至10mL容量瓶中，用正己烷定容。4℃避光保存，有效期1年。7.2.3.12PAHs标准使用溶液(10.0mg/L):用正己烷或异辛烷稀释PAHs标准贮备溶液(7.2.3.11)配制而成，4℃避光保存，有效期6个月。7.2.4仪器与设备7.2.4.3超声萃取仪。7.2.4.4索氏提取器。7.2.4.5旋转蒸发装置。7.2.4.6多孔水浴锅。7.2.4.7玻璃层析柱：长400mm,内径10mm。7.2.4.9毛细管色谱柱：石英SE-54交联柱或等效色谱柱，长25m,内径0.25mm,固定相液膜厚度7.2.4.10实验室常用仪器和设备。7.2.5分析步骤7.2.5.1样品萃取生物样品按下述三种方法中的一种进行萃取：a)索氏提取法：准确称取2.000g～3.000g生物干样，加入2g无水硫酸钠(7.2.3.7),混匀，置于索氏提取器套筒内，加入100mL的二氯甲烷/正己烷混合溶液(7.2.3.5),浸泡12h后在50℃水浴中提取8h。提取液转移至旋转蒸发瓶中，分别用10mL二氯甲烷冲洗索氏提取器2次，淋洗液合并于旋转蒸发瓶中，浓缩至2mL,待净化；b)超声提取法：准确称取2.000g～3.000g生物干样，加入3g无水硫酸钠混匀，装入预先用正己烷浸泡过的圆形滤纸筒内，放入100mL具塞比色管内，加入60mL二氯甲烷/正己烷混合溶液(7.2.3.5),浸泡12h后，超声提取20min,静置。提取液转移至旋转蒸发瓶中，再用20mL二氯甲烷重复超声提取2次，合并提取液，浓缩至2mL,待净化；c)加速溶剂萃取法：准确称取2.000g～3.000g生物干样，加入1g硅藻土(7.2.3.2),混匀，放入萃取池中，按7.1.5.1c)所述条件萃取，萃取液旋转蒸发浓缩至2mL,待净化。7.2.5.2样品净化按以下步骤进行样品净化：a)在玻璃层析柱中加入适量正己烷，依次装填4g硅胶(7.2.3.9)、6g中性氧化铝(7.2.3.8)和1g无水硫酸钠，将液面调整至与无水硫酸钠顶端持平；b)将待净化的浓缩液[7.2.5.la]或7.2.5.1b]或7.2.5.1c]]全量转入玻璃层析柱中，用60mL二氯甲烷/正己烷混合溶液(7.2.3.6)以2mL/min的流量淋洗层析柱，收集淋洗液并旋转蒸发浓缩至1mL左右，加入5mL正己烷，继续浓缩，定容至2.0mL,待测。7.2.5.3工作系列溶液的配制分别移取0mL、0.10mL、0.20mL、0.40mL、0.60mL、0.80mL、1.00mLPAHs标准使用溶液(7.2.3.12)于具塞比色管(或索氏提取器套筒或加速溶剂萃取池)中，按照7.2.5.1和7.2.5.2的规定——升温程序：初温60℃,保持3min;以10℃/min的速度升至180℃,保持2min;以5℃/min的速度升至温285℃,保持10min;——载气：氮气(99.999%);图参见图2。 10——荒；图216种PAHs标准溶液气相色谱图表6GC-FID测定PAHs的重复性、再现性及回收率%%回收率%%%回收率%萘苯并[a]蒽蔗范苯并[b]荧蒽芴苯并[k]荧蒽菲蒽荧蒽二苯并[a,h]蒽芘7.3多环芳烃的测定——高效液相色谱法本方法适用于海洋生物样品中萘、范烯、范、芴、菲、蒽、荧蒽、芘、苯并[a]蒽、施、苯并[b]荧蒽、苯并[k]荧蒽、苯并[a]芘、苯并[g,h,i]花、二苯并[a,h]蒽、茚并[1,2,3-c,d]芘等16种多环测定。方法检出限参见表B.1。7.3.2方法原理海洋生物体中的PAHs,用索氏提取法(或超声提取法或加速溶剂萃取法)提取，用硅胶/氧化铝层析柱净化，用二氯甲烷和正己烷的混合溶液淋洗，高效液相色谱仪测定。7.3.3试剂及其配制7.3.3.1除非另有说明，所用试剂均为色谱纯，有机溶剂浓缩300倍不得检出PAHs。水为正己烷充分洗涤过的蒸馏水或相当纯度的水。7.3.3.3正己烷(C₆H₁₄)。7.3.3.4二氯甲烷(CH₂Cl₂)。7.3.3.6甲醇(CH₄O):用前超声波脱气。7.3.3.7水(H₂O):用前7.3.3.8二氯甲烷/正己烷混合溶液(1+1):等体积的二氯甲烷(7.3.3.4)与正己烷(7.3.3.3)均匀7.3.3.9二氯甲烷/正己烷混合溶液(2+3):将二氯甲烷与正己烷按体积比为2:3的比例均匀混合。7.3.3.10无水硫酸钠(Na₂SO₄):分析纯，550℃烘8h,冷却后装瓶，干燥器中密封保存。7.3.3.11中性氧化铝(Al₂O₃):100目～200目(149μm～74μm),550℃烘8h,于封口玻璃瓶中冷却至室温，每100g加3mL水，充分混匀，干燥器内保存(平衡2h以上方可使用)。7.3.3.12硅胶：120目～200目(124μm～74μm),550℃烘8h,干燥器内保存。并[a]蒽、蔗、苯并[b]荧蒽、苯并[k]荧蒽、苯并[a]芘、茚并[1[g,h,i]花等浓度均为2000mg/L的PAHs标准溶液，4℃避光保存。7.3.3.14PAHs标准贮备溶液(100.0mg/L):准确移取500μLPAHs标准溶液(7.3.3.13)至10mL容量瓶中，用正己烷定容。4℃避光保存，有效期1年。7.3.3.15PAHs标准使用溶液(10.0mg/L):准确移取1.00mLPAHs标准贮备溶液(7.3.3.14)至10mL容量瓶中，用正己烷定容，4℃避光保存，有效期6个月。7.3.4仪器及设备7.3.4.1高效液相色谱仪：具有紫外检测器(UVD)和荧光检测器(FLD)。7.3.4.3超声萃取仪。7.3.4.4索氏提取器。7.3.4.5旋转蒸发装置。7.3.4.6水浴锅。7.3.4.7玻璃层析柱：长400mm,内径10mm。7.3.4.10PAHs专用柱：ZorbaxODS柱，长25cm,内径4.6mm,粒径5μm。7.3.4.11实验室常用仪器和设备。7.3.5分析步骤生物样品按下述三种方法中的任一种进行提取：a)索氏提取法：称取3.000g～5.000g生物干样，加入2g无水硫酸钠(7.3.3.10),混匀，置于索氏提取器套筒内，加入100mL二氯甲烷/正己烷混合溶液(1+1)(7.3.3.8),浸泡12h后，50℃水浴中回流提取8h。提取液转移至旋转蒸发瓶中，用20mL二氯甲烷冲洗索氏提取器b)超声提取法：称取3.000g～5.000g生物干样，加入3g无水硫酸钠，混匀，置于预先用正己烷浸泡过的圆形滤纸筒内，放入具塞比色管内，加入60mL二氯甲烷/正己烷混合溶液(1+1)(7.3.3.8),浸泡12h后，超声提取20min,静置，将提取液转移至旋转蒸发瓶中，用20mL二氯甲烷(7.3.3.4)重复超声提取2次，合并提取液于旋转蒸发瓶中，浓缩至2mL,待净化；c)加速溶剂萃取法：称取2.000g～3.000g生物干样和1g硅藻土(7.3.3.2),混匀，放入萃取池中，按7.1.5.1c)所述条件萃取，萃取液转移至旋转蒸发瓶中，浓缩至1mL,待净化。7.3.5.2样品净化样品按下述步骤净化：a)在玻璃层析柱底部，填紧少许预先用正己烷浸泡过的玻璃纤维，加入40mL正己烷，依次装填4g硅胶(7.3.3.12)、6g中性氧化铝(7.3.3.11)和1g无水硫酸钠，调整正己烷液面与无水硫酸钠顶端持平；b)将提取浓缩液(7.3.5.la)或7.3.5.1b)或7.3.5.1c))全量转移到玻璃层析柱上，打开柱栓，待液面刚好盖住无水硫酸钠层，用80mL二氯甲烷/正己烷(7.3.3.9),以2mL/min的流量淋洗层析柱，淋洗液收集于旋转蒸发瓶中，浓缩至近干，用甲醇定容至2.0mL,待测。7.3.5.3工作曲线的绘制分别移取0mL、0.40mL、0.80mL、1.20mL、1.60mL、2.00mLPAHs标准使用溶液(7.3.3.15)于具塞比色管(或索氏提取器套筒或加速溶剂萃取池)中。按照7.3.5.1和7.3.5.2的规定进行前处理，分别定容至2.0mL,混匀，做为工作系列溶液。得到的工作系列溶液中PAHs的浓度分别为0mg/L、2.00mg/L、4.00mg/L、6.00mg/L、8.00mg/L和10.0mg/L,待测。7.3.5.4样品测定宜参照下述仪器分析条件测定：——紫外检测器的波长：254nm; ——紫外检测器和荧光检测器可单独使用，也可串联使用；——流动相：水(7.3.3.7),甲醇(7.3.3.6);——梯度洗脱程序参见表7。7.3.6.2定量分析测试液中目标化合物的浓度X;。根据式(5)计算样品中目标化合物的含量，结果分别记入表A.5和表7HPLC梯度洗脱程序时间水%甲醇%000表8HPLC测定PAHs的重复性相对标准偏差%1萘2 3范4芴 5菲 6蒽 7荧蒽8芘9苯并[a]蒽蔗苯并[b]荧蒽苯并[k]荧蒽二苯并[a,h]蒽 8酞酸酯类化合物警告——本实验操作过程中需接触大量有机溶剂，且标准物质或溶液均具有高毒性，因此实验应在通风橱内进行。8.1酞酸酯类化合物的测定——气相色谱/质谱联用法8.1.1适用范围本方法适用于生物样品中邻苯二甲酸二甲酯、邻苯二甲酸二乙酯、邻苯二甲酸二丁酯、邻苯二甲酸丁基苄酯、邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯和邻苯二甲酸二正辛酯等6种酞酸酯类化合物的测定。方法检出限参见表B.1。8.1.2方法原理生物体中的酞酸酯类化合物，用正己烷与二氯甲烷混合溶液作提取液，用索氏提取法(或超声提取法或加速溶剂萃取法)提取，提取液经浓缩净化后，用气相色谱/质谱联用仪测定。8.1.3试剂及其配制8.1.3.1除非另有说明，所用试剂均为色谱纯，水为二次蒸馏水或超纯水或相当纯度的水。8.1.3.2硅藻土。8.1.3.3正己烷(C₆H₁₄)。8.1.3.4二氯甲烷(CH₂Cl₂)。8.1.3.5乙醚(C₄H₁₀O)。8.1.3.6乙醚/正己烷混合溶液(1+4):将1体积的乙醚(8.1.3.5)与4体积的正己烷(8.1.3.3)混合8.1.3.7二氯甲烷/正己烷混合溶液(1+1):将等体积的二氯甲烷(8.1.3.4)与正己烷混合均匀。8.1.3.8无水硫酸钠(Na₂SO₄):分析纯，550℃加热8h,干燥器中保存。8.1.3.9中性氧化铝(Al₂O₃):100目～200目(149μm～74μm),550℃烘8h,在封口的玻璃瓶中冷却至室温，每100g加入3.0mL水，充分混匀，置于干燥器中2h后使用。8.1.3.10弗罗里硅土：100目～200目(149μm～74μm),140℃烘16h,于封口玻璃瓶中冷却至室温，每100g加3mL水去活，振荡混匀，置于干燥器中2h后使用。8.1.3.11酞酸酯标准溶液(2000mg/L):邻苯二甲酸二甲酯、邻苯二甲酸二乙酯、邻苯二甲酸二丁酯、邻苯二甲酸丁基苄酯、邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯和邻苯二甲酸二正辛酯等浓度为2000mg/L的酞酸酯标准溶液。8.1.3.12替代标准溶液(2000mg/L):氘代邻苯二甲酸二丁酯和氘代邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯等浓度为2000mg/L的替代标准溶液。8.1.3.13内标物标准溶液(2000mg/L):氘代邻苯二甲酸二戊酯浓度为2000mg/L的标准溶液。8.1.3.14酞酸酯标准贮备溶液(100.0mg/L):移取500μL酞酸酯标准溶液(8.1.3.11)至10mL容量瓶中，用正己烷定容。4℃保存，有效期6个月。8.1.3.15酞酸酯标准使用溶液(10.00mg/L):移取1.00mL酞酸酯标准贮备溶液(8.1.3.14)至10mL容量瓶中，用正己烷定容。使用前配制。8.1.3.16替代标准贮备溶液(100.0mg/L):移取500μL替代标准溶液(8.1.3.12)至10mL容量瓶8.1.3.17替代标准使用溶液(10.00mg/L):移取1.00mL替代标准贮备溶液(8.1.3.16)至10mL8.1.3.18内标物标准贮备溶液(100.0mg/L):移取500μL内标物标准溶液(8.1.3.13)至10mL容量瓶中，用正己烷定容。4℃避光保存，有效期6个月。8.1.3.19内标物标准使用溶液(10.00mg/L):移取1.00mL内标物标准贮备溶液(8.1.3.18)至10mL容量瓶中，用正己烷定容。使用前配制。8.1.4仪器与设备8.1.4.1气相色谱/质谱仪(GC-MS)。8.1.4.2毛细管柱：DB-5MS(5%苯基+95%聚二甲基硅氧烷)或等效色谱柱，长30m,内径0.25mm,固定相液膜厚度0.25μm:8.1.4.4索氏提取器。8.1.4.5超声波清洗器。8.1.4.6旋转蒸发装置。8.1.4.7氮吹仪。8.1.4.8玻璃层析柱：长300mm,内径10mm。8.1.4.9实验室常用仪器与设备。8.1.5分析步骤8.1.5.1样品提取生物样品按下述三种方法中的一种进行提取：a)索氏提取法：准确称取2.000g～3.000g生物干样和2g无水硫酸钠(8.1.3.8),混匀，置于索氏提取器套筒内，加入100mL二氯甲烷/正己烷混合溶液(8.1.3.7),加入50.0μL替代标准使用溶液(8.1.3.17),浸泡12h后，于50℃水浴中回流提取8h。提取液转移至旋转蒸发瓶中，分别用20mL二氯甲烷冲洗索氏提取器2次，合并冲洗液于旋转蒸发瓶中，浓缩至2mLb)超声提取法：准确称取2.000g～3.000g生物干样和2g无水硫酸钠，混匀，置于预先用正己烷浸泡过的圆形滤纸筒内，放入100mL具塞比色管内，加入60mL二氯甲烷/正己烷混合溶液(8.1.3.7),加入50.0μL替代标准使用溶液(8.1.3.17),浸泡12h后，超声提取20min,静置5min,将提取液转移至旋转蒸发瓶中，分别用20mL二氯甲烷重复超声提取2次，合并冲c)加速溶剂萃取法：准确称取2.000g～3.000g生物干样和1g硅藻土(8.1.3.2),加入50.0μL替代标准使用溶液(8.1.3.17),混匀，放入萃取池中，按7.1.5.1c)所述条件萃取，萃取液转移至旋转蒸发瓶中，浓缩至2mL左右，待净化。8.1.5.2样品净化样品按下述步骤净化：a)在玻璃层析柱中加入适量正己烷，依次加入4.0g中性氧化铝(8.1.3.9)和2.0g弗罗里硅土(8.1.3.10),上层加入3.0g无水硫酸钠，将液面调整至与无水硫酸钠顶端持平；b)将待净化的浓缩液(8.1.5.1a)或8.1.5.1b]或8.1.5.1c]]全量转入层析柱中，用35mL正己c)用100mL乙醚/正己烷混合溶液(8.1.3.6)洗脱，收集洗脱液至旋转蒸发瓶中，浓缩至2mL左右，加入5mL正己烷，继续浓缩至2mL左右，将浓缩液全量转移至氮吹管中，氮吹至1mL分别移取100μL、250μL、500μL、750μL和1000μL酞酸酯标准使用溶液(8.1.3.15)至——升温程序：初温50℃,以15℃/min的速度升至200℃,保持1min;以15℃/min的速度升至250℃,保持3min,以20℃/min的速度升至280℃,保持5min。助确证。参见图4和表9。采用内标法定量。样品测试液中目标化合物的浓度可由计算机按内标法自动计算。根据式(6)计8.1.9注意事项图46种酞酸酯标准溶液气相色谱/质谱图表9GC-MS测定酞酸酯的定量离子参数表10GC-MS测定酞酸酯的重复性、再现性及回收率%%回收率%8.2酞酸酯类化合物的测定——气相色谱法8.2.1适用范围本方法适用于生物样品中邻苯二甲酸二甲酯、邻苯二甲酸二乙酯、邻苯二甲酸二丁酯、邻苯二甲酸丁基苄酯、邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯和邻苯二甲酸二正辛酯等6种酞酸酯类化合物的测定。方法检出限参见表B.1。用二氯甲烷/正己烷混合溶液提取生物样品中的酞酸酯类化合物，经浓缩净化后用具电子捕获检测器的气相色谱仪(GC-ECD)测定。8.2.3试剂及其配制8.2.3.1除非另有说明，所用试剂均为色谱纯。水为正己烷充分洗涤过的蒸馏水或超纯水或相当纯度8.2.3.3正己烷(C₆H₁₄)。8.2.3.4二氯甲烷(CH₂Cl₂)。8.2.3.7二氯甲烷/正己烷混合溶液(1+1):将等体积的二氯甲烷(8.2.3.4)与正己烷(8.2.3.3)混合8.2.3.8乙醚/正己烷混合溶液(1+4):将1体积的乙醚(8.2.3.6)与4体积的正己烷(8.2.3.3)混合均匀.8.2.3.9无水硫酸钠(Na₂SO₄):分析纯，550℃加热8h,干燥器中保存；8.2.3.10中性氧化铝(Al₂O₃):100目～200目(149μm～74μm),550℃烘8h,在封口的玻璃瓶中冷却至室温。每100g中性氧化铝加入3mL水，充分混匀，置于干燥器中2h后使用；8.2.3.11弗罗里硅土：100目～200目(149μm～74μm),140℃加热16h,于封口玻璃瓶中冷却至室温，每100g加入3mL水，充分混匀，干燥器内保存(平衡2h以上方可使用)。8.2.3.12酞酸酯标准溶液(2000mg/L):邻苯二甲酸二甲酯、邻苯二甲酸二乙酯、邻苯二甲酸二丁酯、邻苯二甲酸丁基苄酯、邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯和邻苯二甲酸二正辛酯等浓度为2000mg/L的混合溶液。8.2.3.13酞酸酯标准贮备溶液(100.0mg/L):取500μL酞酸酯标准溶液(8.2.3.12)至10mL容量瓶，用正己烷定容至刻线，4℃避光保存，有效期6个月。8.2.3.14酞酸酯标准使用溶液(10.00mg/L):取1.00mL酞酸酯标准贮备溶液(8.2.3.13)至10mL8.2.4仪器与设备8.2.4.1气相色谱仪：带电子捕获检测器(GC-ECD)。8.2.4.2毛细管柱：DB-5(5%苯基+95%聚二甲基硅氧烷)或等效色谱柱，长30m,内径0.25mm,固定相液膜厚度0.25μm。8.2.4.3索氏提取器。8.2.4.4超声波清洗器。8.2.4.5加速溶剂萃取仪，附萃取池。8.2.4.6旋转蒸发装置。8.2.4.7氮吹仪。8.2.4.8玻璃层析柱：长300mm,内径10mm。8.2.4.9实验室常用仪器与设备。8.2.5分析步骤8.2.5.1样品提取生物样品按下述三种方法中的一种进行提取：a)索氏提取法：准确称取2.000g～3.000g生物干样，加入10g无水硫酸钠(8.2.3.9)研磨混匀，置于索氏提取器套筒内，加入100mL二氯甲烷/正己烷混合溶液(8.2.3.7),浸泡12h后在50℃水浴中提取8h,提取液转入旋转蒸发瓶，分别用10mL二氯甲烷淋洗索氏提取器b)超声提取法：准确称取2.000g～3.000g生物干样，加入10g无水硫酸钠混匀，装入预先用正己烷浸泡过的圆形滤纸筒内，将滤纸筒装入100mL具塞比色管内，加入60mL二氯甲烷/正己烷混合液，浸泡12h;超声提取20min,静置。提取液移入旋转蒸发瓶中；再用20mL二氯甲烷重复提取2次，合并提取液。提取液浓缩至2mL,待净化；c)加速溶剂萃取法：准确称取2.000g～3.000g生物干样，加入1g硅藻土(8.2.3.2),混匀，放入萃取池中，按7.1.5.1c)所述条件萃取，萃取液旋转蒸发浓缩至2mL,待净化。8.2.5.2样品净化样品按下述步骤净化：a)在玻璃层析柱中加入适量正己烷，依次加入4.0g中性氧化铝(8.2.3.10)和6.0g弗罗里硅土(8.2.3.11),上层加入3.0g无水硫酸钠，将液面调整至与无水硫酸钠顶端持平；b)将待净化的浓缩液[8.2.5.la]或8.2.5.1b]或8.2.5.1c]]全量转入层析柱中，用35mL正己c)用100mL乙醚/正己烷混合溶液(8.2.3.8)淋洗，收集洗脱液，旋转蒸发浓缩至2mL左右，再加入5mL正己烷，继续浓缩至2mL左右，浓缩液氮吹至近干；用正己烷定容至1.0mL,8.2.5.3标准系列溶液的配制分别移取100μL、250μL、500μL、750μL和1000μL酞酸酯标准使用溶液(8.2.3.14)至10mL容量瓶中，用正己烷定容至刻线，配制成0.100mg/L、0.250mg/L、0.500mg/L、0.750mg/L和1.00mg/L的标准系列溶液。8.2.5.4样品测定宜参照下述仪器分析条件测定：——升温程序：初温80℃;以20℃/min的速度升至180℃;以5℃/min的速度升至250℃,保持——载气：氮气(99.999%);8.2.6记录与计算8.2.6.1定性分析通过比较标准溶液和样品的保留时间(RT)进行目标化合物的定性。酞酸酯标准溶液的气相色谱图参见图5。8.2.6.2定量分析以标准系列溶液的浓度C为纵坐标，其对应的峰面积为横坐标，绘制标准曲线，反演出样品测试液中目标化合物的浓度X;。根据式(7)计算样品中目标化合物的含量，结果分别记入表A.8和表A.9。式中：o,——生物样品中目标化合物的含量，质量分数(10-°);X;——样品测试液中目标化合物的浓度，单位为微克每V₁——样品测试液的定容体积，单位为毫升(mL);8.2.7精密度与正确度五家实验室测定同一生物样品，重复性相对标准偏差、再现性相对标准偏差及回收率参见表11。8.2.8注意事项本方法使用时应注意以下事项：——实验过程中应使用全玻璃或聚四氟乙烯材质的容器设备；——实验中所用器皿，使用前用二氯甲烷冲洗；——实验中所用试剂，使用前做空白检验。图56种酞酸酯标准溶液气相色谱图表11GC-ECD测定酞酸酯的重复性、再现性及回收率组分名%%回收率%1234569有机磷农药的测定——气相色谱法警告——本实验操作过程中需接触大量有机溶剂，且标准物质或溶液均具有高毒性，因此实验应在通风橱内进行。9.1适用范围本方法适用于生物样品中甲基对硫磷、杀扑磷、对硫磷、乙硫磷、马拉硫磷、杀螟松、异稻瘟净、乐果、二嗪农、速灭磷、敌敌畏、稻丰散、水胺硫磷、甲拌磷等14种有机磷农药类的测定。方法检出限参见9.2方法原理生物样品经丙酮与二氯甲烷的混合溶液提取，经浓缩净化，用气相色谱/火焰光度检测器检测，以保留时间定性，外标法定量。9.3试剂及其配制9.3.1除非另有说明，所用试剂均为色谱纯。水为正己烷充分洗涤过的蒸馏水或超纯水或相当纯度的水。9.3.2正己烷(C₆H₄)。9.3.3二氯甲烷(CH₂Cl₂)。9.3.5乙酸乙酯(C₄H₈O₂)。9.3.6环己烷(C₆H₁₂)。9.3.7氯化钠(NaCl):分析纯。9.3.8无水硫酸钠(Na₂SO₄):分析纯，550℃加热8h,干燥器中保存。9.3.10乙酸乙酯/环己烷混合溶液(1+1):将等体积的乙酸乙酯(9.3.5)与环己烷(9.3.6)混合均匀。9.3.11有机磷农药标准物质：纯度为98%以上的单组份有机磷农药标准物质，包括甲基对硫磷、杀扑拌磷等14种。9.3.12有机磷农药单组分标准溶液(1000.0mg/L):取14个10mL棕色容量瓶，分别加入少量正己烷，分别称取14种有机磷农药标准物质(9.3.11)0.0100g于各容量瓶中，正己烷定容，混匀。4℃避光保存，有效期1年。9.3.13有机磷农药混和标准溶液(50.00mg/L):10mL棕色容量瓶中加入少量正己烷，分别移取14种有机磷农药单组分标准溶液(9.3.12)各500μL于容量瓶中，用正己烷定容，混匀。4℃避光保存，有效期6个月。9.3.14有机磷农药混合标准使用溶液(1.000mg/L):10mL棕色容量瓶中加入少量正己烷，移取有机磷农药混合标准溶液(9.3.13)200μL于容量瓶中，用正己烷定容。4℃避光保存，有效期2个月。9.4仪器与设备9.4.1气相色谱仪：具火焰光度检测器(GC-FPD)。9.4.2毛细管色谱柱：DB-5(5%苯基+95%聚二甲基硅氧烷)或等效色谱柱，长30m,内径0.25mm,固定相液膜厚度0.25μm:9.4.3旋转蒸发装置。9.4.4凝胶净化柱：长300mm,内径25mm。9.4.5恒温烘箱。9.4.6均质器。9.4.7氮吹仪。9.4.8实验室常用仪器与设备。9.5分析步骤生物样品按下述步骤提取：a)生物样品去壳或腮，组织匀浆后准确称取20.0g于离心瓶中，加入8mL水；b)量取40mL丙酮(9.3.4)至离心瓶中，用均质器以15000r/min的转速均质提取1.5min;c)继续加入6g氯化钠(9.3.7),充分摇匀，加入30mL二氯甲烷(9.3.3),用均质器以15000r/min的转速均质提取2.5min;d)提取液以3000r/min的转速离心3min,上清液经装有无水硫酸钠(9.3.8)的漏斗过滤于旋转蒸发瓶中；e)向离心瓶中继续加入40mL丙酮和30mL二氯甲烷，以15000r/min的转速均质提取2.5min,按步骤d)合并上清液；f)重复步骤e);g)提取后的上清液，于40℃旋转蒸发浓缩至约2mL;加入5mL乙酸乙酯/环已烷混合溶液(9.3.10),浓缩至约2mL;再次加入2mL乙酸乙酯/环己烷混合溶液，浓缩至约1mL,待净化。9.5.2样品净化样品按下述步骤净化：a)取适量凝胶(9.3.9)于小烧杯中，加入乙酸乙酯/环己烷混合溶液并搅拌均匀，装入层析柱中，保持凝胶始终在乙酸乙酯/环己烷混合溶液中，同样的方法填装另外一根凝胶柱；b)将浓缩液(9.5.1g)]全量转移至第一根凝胶柱上，用70mL乙酸乙酯/环己烷混合溶液洗脱，弃去前35mL流出液，收集(35mL～70mL)流出液；c)流出液旋转蒸发浓缩至约1mL;d)将浓缩液9.5.2c)全量转移至第二根凝胶柱上，用70mL乙酸乙酯/环己烷混合溶液洗脱，弃去前35mL流出液，收集(35mL～70mL)流出液；e)浓缩流出液，氮吹至1mL左右，以乙酸乙酯(9.3.5)定容至1.0mL,待测。农药混合标准使用溶液(9.3.14),用正已烷定容至10mL,混匀，配制成5.00μg/L、10.0pg/L、20.0μg/L、50.0pg/L和1——升温程序：初温60℃,保持2min;以30℃/min的速度升至180℃,保持2min;以8℃/min的速度升至250℃,保持3min;以20℃/min的速度升至270℃,保持5min;通过比较样品与标准溶液的色谱峰的保留时间(RT)进行目标化合物的定性。可参考图6的出峰 (8)图614种有机磷农药标准溶液气相色谱图表12GC-FPD测定有机磷农药的重复性、再现性及回收率%%回收率%甲拌磷乐果二嗪农甲基对硫磷杀螟松马拉硫磷乙硫磷10有机锡的测定——气相色谱法警告——本实验操作过程中需接触大量有机溶剂，且标准物质或溶液均具有高毒性，因此实验应在通风橱内进行。10.1适用范围本方法适用于海洋生物样品中一丁基锡(MBT)、二丁基锡(DBT)及三丁基锡(TBT)等有机锡化合物的测定。方法检出限参见表B.1。10.2方法原理环庚三烯酚酮与生物样品中的有机锡反应生成有机锡络合物，用正己烷萃取有机锡络合物，再用过量的格氏试剂将有机锡络合物转化为低沸点的四烷基锡，破坏掉过量的格氏试剂后再次用正己烷萃取，经净化浓缩后用气相色谱测定。10.3试剂及其制备10.3.1除非另有说明，所用试剂均为色谱纯。水为正己烷充分洗涤过的蒸馏水或超纯水或相当纯度10.3.2正己烷(C₆H₁₄)。10.3.3异辛烷(C₈H₁g)。10.3.6无水乙醚(C₄H₀O):分析纯。10.3.7重蒸无水乙醚(C₄H₀O):无水乙醚(10.3.6)中加入少量的金属钠丝，40℃水浴氮气保护下回流3h后收集馏分。10.3.8溴代正戊烷(C₅H₁Br):分析纯。10.3.9盐酸溶液：移取0.5mL的盐酸(10.3.5),用水稀释至1L。10.3.10镁粉：依次用盐酸溶液(10.3.9)、水、无水乙醚(10.3.6)淋洗后室温下减压抽干。10.3.11无水硫酸钠(Na₂SO₄):分析纯，550℃烘8h,冷却后装瓶，干燥器中密封保存。10.3.12弗罗里硅土：100目～200目(149μm～74μm),400℃加热4h,于封口玻璃瓶中冷却至室温，每100g加入3mL水，振荡混匀，干燥器内保存10.3.13硫酸溶液(1+17):搅拌下将100mL浓硫酸(H₂SO₄,p=1.84g/mL)加入到1700mL水中。10.3.14盐酸/甲醇混合溶液(1+1):将等体积盐酸(10.3.5)与甲醇(10.3.4)混合均匀。10.3.15环庚三烯酚酮溶液：称取0.5g环庚三烯酚酮(C₇H₆O₂)溶于100mL正己烷(10.3.2)中。10.3.16有机锡标准溶液(2000mg/L):MBT、DBT和TBT等浓度为2000mg/L的有机锡标准10.3.17三丙基锡标准溶液(TPrT):TPrT浓度为2000mg/L的标准溶液。10.3.18有机锡标准贮备液(100.0mg/L):准确移取500μL有机锡标准溶液(10.3.16)至10mL容量瓶中，用异辛烷(10.3.3)定容。4℃避光保存，有效期6个月。10.3.19有机锡标准使用溶液(10.00mg/L):准确移取1.00mL有机锡标准贮备溶液(10.3.18)至10mL容量瓶中，用异辛烷(10.3.3)定容。4℃避光保存，有效期4个月。10.3.20替代标准贮备溶液(100.0mg/L):准确移取500μL替代标准溶液(10.3.17)至10mL容量瓶中，用异辛烷定容。4℃避光保存，有效期6个月。10.3.21替代标准使用溶液(10.00mg/L):准确移取1.00mL替代标准贮备溶液(10.3.20)至10mL容量瓶中，用异辛烷定容。4℃避光保存，有效期4个月。10.3.22格氏试剂：正戊基溴化镁的乙醚溶液(2mol/L)。制备方法如下：三口瓶中依次加入8.0g镁粉(10.3.10)、50mL重蒸无水乙醚(10.3.7),等压滴液漏斗中加入40mL的溴代正戊烷(10.3.8)和20mL重蒸无水乙醚(10.3.7)混匀，三口瓶斜口接等压滴液漏斗，直口接冷凝器，10℃左右循环水冷凝。氮气保护下，缓慢滴加约1mL溴代正戊烷的无水乙醚溶液，待反应反应平缓后，开动电磁搅拌并继续滴加剩余的溴代正戊烷的无水乙醚溶液，控制滴加速度在8mL/min左右以维持反应溶液微沸。滴加完毕后可用水浴40℃回流4h,以保持乙醚微沸直至镁粉反应完全。将制好的格氏试剂转入密封瓶中隔绝空气密封保存，存于干燥器中备用。10.4仪器及设备10.4.1气相色谱仪：带火焰光度检测器(GC-FPD),配610nm滤光片。10.4.2旋转蒸发装置。10.4.3恒温烘箱。10.4.6低温循环冷凝水泵。10.4.9蛇形冷凝器。10.4.10电热恒温水浴锅。10.4.13玻璃层析柱：长300mm,内径10mm。10.4.14实验室常用仪器与设备。10.5分析步骤样品按下述步骤萃取：a)准确称取3.000g～5.000g生物干样，加入10μL替代标准使用溶液(10.3.21),加入15mL盐酸/甲醇混合溶液(10.3.14),浸泡过夜，振摇1min后静置分层，萃取液转移至旋转蒸发瓶，再用10mL盐酸/甲醇混合溶液萃取一次，合并萃取液；b)萃取液10.5.la)分别用10mL环庚三烯酚酮溶液(10.3.15)和20mL正己烷萃取，静置分层，合并有机相；c)有机相10.5.1b)中加入10g无水硫酸钠(10.3.11),振摇1min,旋转蒸发浓缩至约2mL;d)浓缩液10.5.1c)中加入1.5mL格氏试剂(10.3.22),振摇3min后置于40℃的电热恒温水浴锅中反应40min;e)将反应好的有机相10.5.1d)置于冰水浴中，缓慢滴加1mL～2mL水，再加入10mL硫酸溶液(10.3.13),最后加入40mL水，静置分层；f)转移有机相，水相继续用20mL正己烷均分两次萃取，萃取液合并至有机相。用无水硫酸钠干燥，旋转蒸发浓缩至2mL,待净化。衍生瓶中分别加入10μL替代标准使用溶液(10.3.21),按照10.5.1d)～10.5.1f)的步骤进行前处理，——毛细管色谱柱：DB-5(5%苯基+95%聚二甲基硅氧烷)或等效色谱柱，长30m,内径0.25mm,——升温程序：初温80℃,保持1min;以5℃/min的速度升温至190℃,再以10℃/min的速度升温至280℃,保持5min;图7。 (9)V₁——样品测试液的定容体积，单位为毫升(mL);M——样品取样量，单位为克(g)。10.7精密度与正确度五家实验室测定同一生物样品，重复性相对标准偏差、再现性相对标准偏差及回收率参见表13。10.8注意事项本方法使用时应注意以下事项：——所有玻璃器皿在临用前应洗净，可用洗涤剂、水、甲醇顺序洗涤；——萃取过程中乳化现象严重时可加入氯化钠或采用离心法破乳；——格氏试剂接触水会迅速分解并放热，保存时注意隔绝空气并在干燥器中保存。 图7有机锡化合物标准溶液气相色谱图表13GC-FPD测定有机锡化合物的重复性、再现性及回收率%%回收率%11多溴联苯醚的测定——气相色谱/质谱联用法警告——本实验操作过程中需接触大量有机溶剂，且标准物质或溶液均具有高毒性，因此实验应在通风橱内进行。11.1适用范围本方法适用于生物样品中2,4,4'-三溴联苯醚(2,4,4'-TrBDE)、2,2',4,4'-四溴联苯醚(2,2',4,4'-TeBDE)、2,2',4,4',5-五溴联苯醚(2,2',4,4',5-PeBDE)、2,2',4,4',6-五溴联苯醚(2,2',4,4',6-PeBDE)、2,2',4,4',5,5'-六溴联苯醚(2,2',4,4',5,5'-HxBDE)、2,2',4,4',5',6-六溴联苯醚(2,2',4,4',5',6-HxBDE)和2,2',3,4,4',5',6-七溴联苯醚(2,2',3,4,4',5',6-HpBDE)等7种多溴联苯醚(PB-DEs)的测定。方法检出限参见表B.1。11.2方法原理生物体中的多溴联苯醚，用正己烷与二氯甲烷的混合溶液提取，提取液经净化浓缩后，用气相色谱/质谱联用仪(配有负化学源)测定。11.3试剂及其配制11.3.1除非另有说明，所用试剂均为色谱纯，有机溶剂浓缩300倍不得检出多溴联苯醚。水为正己烷充分洗涤过的蒸馏水或超纯水或相当纯度的水。11.3.2硅藻土。11.3.3正己烷(C₆H₁₄)。11.3.4二氯甲烷(CH₂Cl₂)。11.3.6二氯甲烷/正己烷混合溶液(1+1):将等体积的正己烷(11.3.3)与二氯甲烷(11.3.4)混合均匀。