GB∕T 43163-2023 苜蓿黄萎病菌溯源检测方法（正式版）

苜蓿黄萎病菌溯源检测方法2023-09-07发布国家市场监督管理总局国家标准化管理委员会I本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口。本文件起草单位：中华人民共和国深圳海关、深圳市检验检疫科学研究院。1苜蓿黄萎病菌溯源检测方法1范围本文件描述了应用基因片段和生物信息学分析方法对苜蓿黄萎病菌进行溯源检测的方法。本文件适用于苜蓿黄萎病菌相关寄主植物材料中携带的苜蓿黄萎病菌的溯源检测。2规范性引用文件本文件没有规范性引用文件。3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。邻接法neighbor-joining基于最小演化准则的迭代聚类方法。4方法原理苜蓿黄萎病菌，拉丁名Verticilliumalbo-atrumReinkeetBerthold,基本信息见附录A。溯源是利用对物种有进化和溯源价值的基因片段将核酸序列信息与来源地、寄主等来源信息进行相关性归类。检测过程是应用生物信息学的分析手段筛选有效区分种内差异并且有效归类的基因片段或分子标记，获得这些基因片段或分子标记的核酸序列，应用统计学手段完成核酸序列与来源地、寄主信息的主成分分析，完成不同来源地、寄主个体的群体分子系统进化关系和群体结构分析，基于基因序列的相似度和重复率等，构建网络进化图。5仪器和试剂5.1仪器与试验用具5.2试剂试剂：70%酒精、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、PCRTaq酶、PCRTaq缓冲液、dNTP、DNA标马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA):200g去皮土豆切成小方块，加入1000mL无菌水，煮沸15min,四层纱布过滤得到滤液，滤液中加入18g葡萄糖、18g琼脂粉，加热溶解后将溶液定容至1000mL,分装至三角瓶中，121℃高压蒸汽灭菌20min。26溯源检测方法6.1DNA提取与纯化对真菌进行液体培养或平板培养，按附录B中CTAB法对基因组DNA进行提取，溶解于无菌超纯水中，测定DNA浓度及纯度后，保存于一20℃冰箱备用。6.2基因片段或分子标记的扩增与测序内部转录间隔区(ITS片段)作为溯源分析的基因片段进行PCR扩增(具体步骤见附录C),测序。测序结果利用通用序列编辑软件进行剪接编辑，比对峰图和正反向测序结果是否有误，去掉两端引物部分序列。6.3分子系统进化分析将拼接的序列导入通用分子系统进化分析软件，同时导入苜蓿黄萎病菌溯源序列排列文件mas格式或meg格式，对全部序列进行排列，排列结果见附录D。对排列后的mas格式文件，基于邻接法构建分子系统进化树(见附录E)。选择Bootstrap检验1000次重复，其他参数选择默认参数。7结果判定根据待分析序列在系统进化树上与已溯源苜蓿黄萎病菌的分支聚集结果进行判定。——如果序列与已溯源菌株序列聚为一支，且自展值为100%,即可判定该物种序列与已知溯源信息序列具有相同的来源地、寄主信息。——如果序列与已溯源菌株序列未与任一物种序列聚为一支，需结合网络进化图做出判定。在构建的网络进化图中寻找待分析序列的进化分支起源点和方向，确认突变衍化历史。——如同一分支起源点的其他方向分支信息具有相关性，则可判定待分析个体与同一起源点不同个体的来源地和寄主信息具有相关性。——如果同一分支起源点无其他方向分支，则无法判定待分析个体的来源地和寄主信息。8样品与原始数据集保存8.1样品保存分离得到的菌种转移至马铃薯葡萄糖斜面培养基，置于4℃黑暗条件下保存至少6个月，以备复8.2结果记录与资料保存和审核人员签字。PCR凝胶电泳检测需有电泳结果照片，序列需要保存电子文件。3(资料性)苜蓿黄萎病菌相关信息A.1基本信息分类地位：Fungi,Plectosphaerellaceae,Glomerellales,Hypocreomycetidae,Sordariomycetes,As-comycota。A.2寄主范围exserta、草莓Fragariaananassa、大豆属Glycine、大豆Glycinemax、地中海岩黄芪Hedysarumcoro-narium、栽培向日葵Helianthusannuusvar.marcocarpus、律草属Humulus、啤酒花HumulusMedicago、紫苜蓿Medicagosativa、草木犀属Melilotus、草木犀Melilotussuaveolens、驴喜豆Onobry-pratense、白车轴草Trifoliumrepens、蚕豆Viciafaba。A.3地理分布A.4症状病株初期上部叶片在温度较高时表现暂时性萎蔫，继而中下部叶片失绿变黄，严重时变枯白色，表现整株萎蔫症状，横切病株茎部，可见维管束变褐。发病后期，植株因生育停滞而严重矮化。小叶顶端出现V形黄变坏死斑块，严重时病叶卷缩扭曲；病株叶片枯萎，但茎部在较长时间内仍保持绿色；在潮湿条件下，枯死茎表现为病原菌轮枝状分生孢子梗覆盖，呈灰色。4GB/T43163—2023(规范性)基因组DNA制备B.1.1试验器皿于121℃、30min湿热灭菌或180℃干热灭菌1h。B.1.2从培养基上刮取100mg左右的菌丝体至研钵内，加入液氮充分研磨，加入4mL预热的CTAB抽提液。B.1.3将离心管放入水浴锅前先振荡1min,然后放入65℃水浴锅水浴15min,每隔3min～5min振B.1.4加入等体积三氯甲烷，用移液器混匀1min,水浴10min;4℃,12000g离心15min,取上清液加等体积异丙醇，轻轻摇匀，然后一20℃静置15min。B.1.54℃,12000g离心15min,小心去除上清液，留沉淀；加70%预冷酒精，洗涤3次，放于通风处干燥；加入50μL～100μL灭菌的去离子水溶B.2DNA浓度及纯度测定用核酸蛋白分析仪测定DNA的纯度与浓度，分别取得260nm和280nm处的吸收值，计算核酸的纯度和浓度，按照公式(B.1)计算DNA纯度，按照公式(B.2)计算DNA浓度：p=50×OD₂…………(B.2)式中：conc.——DNA纯度；p——DNA质量浓度，单位为微克每毫升(μg/mL);OD₂s₀——260nm处吸光光度值，核酸的吸光度；OD₂so——280nm处吸光光度值，蛋白质的吸光度。计算结果保留一位小数。PCR级DNA溶液的OD₂so/OD₂s比值为1.7～1.9。5(资料性)溯源基因片段扩增流程C.1.1反应条件94℃预变性4min;94℃变性30s,56℃复性20s,72℃延伸30s,40个循环；72℃延伸7min。C.1.2引物序列前向引物：ITS1:5'-TCCGTAGGTC.1.3扩增体系及条件扩增反应的组成成分见表C.1。表C.1PCR扩增体系组分组分加样量10×PCR缓冲液后向引物(10μmol/L)5U/μLTaq酶补无菌水至反应用双蒸水作空白对照，阳性对照采用含有苜蓿黄萎病菌的DNA作为模板，每个样品重复2次。C.2测序与序列处理扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离，使用DNA标记参照，经DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒回收纯化，采用核酸蛋白分析仪对DNA进行定量检测。测序引物与PCR扩增引物相同，进行测序。6(资料性)已鉴定苜蓿黄萎病菌溯源序列排列结果>AB353342.1Japan-Potato/SolanumtuberosumCCCTTTGTGACCATATTGTTGCTTGGGCTCGTTCGCGCCGCCGGTACTCAGTCTCTTTATTCATACCAACGATACTTCTGAGTGTTCTTACGAACTATTAAAATTTTAACAGGATCTCTTGCTCTAGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAAGCGATTGTAGTGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATGGCGCCTTCAGTATCCTGGGAGGCATGCCTGTCCGAGCGTCGTTTCAACCCTCGAGCCCCAGTGGCCGGTGTTGGGATCTACGTCTGTAGGCCCTTAAAAGCAGTGGCGGACCCGCGTGGCCCTTCTTGCGTAGTAATTACAGCTCGCATCGGAGTCCC>DQ266223.1England-Hop/HumuluslupulusCCCTTTGTGACCATATTGTTGCTTGGGCTCGTTCGCGCCGCCGGTACTCAGTCTCTTTATTCATACCAACGATACTTCTGAGTGTTCTTACGAACTATTAAAATTTTAACAGGATCTCTTGCTCTAGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAAGCGATTGTAGTGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATGGCGCCTTCAGTATCCTGGGAGGCATGCCTGTCCGAGCGTCGTTTCAACCCTCGAGCCCCAGTGGCCGGTGTTGGGATCTACGTCTGTAGGCCCTTAAAAGCAGTGGCGGACCCGCGTGGCCCTTCTTGCGTAGTAATTACAGCTCGCATCGGAGTCCC>GQ495790.1Canada-Alfalfa/MedicagosativaCCCTTTGTGACCATATTGTTGCTTGGGCTCGTTCGCGCCGCCGGTACTCAGTCTCTTTATTTATACCAACGATACTTCTGAGTGTTCTTACGAACTATTAAAATTTTAACAGGATCTCTTGCTCTAGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAAGCGATTGTAGTGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATGGCGCCTTCAGTATCCTGGGAGGCATGCCTGTCCGAGCGTCGTTTCAACCCTCGAGCCCCAGTGGCCGGTGTTGGGATCTACGTCTGTAGGCCCTTAAAAGCAGTGGCGGACCCGCGTGGCCCTTCTTGCGTAGTAATTACAGCTCGCATCGGAGTCCCGC>AF108476.1Canada-Alfalfa/MedicagosativaCCCTTTGTGACCATATTGTTGCTTGGGCTCGTTCGCGCCGCCGGTACTCAGTCTCTTTATTTATACCAACGATACTTCTGAGTGTTCTTACGAACTATTAAAATTTTAACAGGATCTCTTGCTCTAGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAAGCGATTGTAGTGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATGGCGCCTTCAGTATCCTGGGAGGCATGCCTGTCCGAGCGTCGTTTCAACCCTCGAGCCCCAGTGGCCGGTGTTGGGATCTACGTCTGTAGGCCCTTAAAAGCAGTGGCGGACCCGCGTGGCCCTTCTTGCGTAGTAATTACAGCTCGCATCGGAGTCC>★AB458830.1Xinjiang,China-Alfalfa/MedicagosativaCCCTTTGTGACCATATTGTTGCTTGGGCTCGTTCGCGCCGCCGGTACTCAGTCTCTTTATT7CATACCAACGATACTTCTGAGTGTTCTTACGAACTACTCTAGCATCGATGAAGAACGCAGCAATCATCGAATCTTTGAACGCACATGGCGCCTTCAGCGTCGTTTCAACCCTCGAGCCCCAAAAGCAGTGGCGGACCCGCGTGGCCCTTCTTGCGTAGTAATTACAGCT>JQ629956.1Slovenia-Hop/HumuluslupulusCCCTTTGTGACCATATTGTTGCTTGGGCTCGTTCCATACCAACGATACTTCTGAGTGTTCTTACGAACTACTCTAGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAAGCGATTGTAAATCATCGAATCTTTGAACGCACATGGCGCCTTCAGTATCCTGGGAGGGCGTCGTTTCAACCCTCGAGCCCCAGTGGCCGGTGTAAAGCAGTGGCGGACCCGCGTGGCCCTTCTTGCGTAGTAATTACAGCTC>DQ825977.1USA-ApiumgraveolensCCCTTTGTGACCATATTGTTGCTTGGGCTCGTTCGATACCAACGATACTTCTGAGTGTTCTTACGAACTATTAAAATTTTAATCTAGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAAGCGATTGTAGTGTATCATCGAATCTTTGAACGCACATGGCGCCTTCAGTATCCTGGGAGGCCGTCGTTTCAACCCTCGAGCCCCAGTGGCCGGTGTTGAGCAGTGGCGGACCCGCGTGGCCCTTCTTGCGTAGTAATTACAGCTCGC>AF364015.1Belgium-Hop/HumuluslupulusCCCTTTGTGACCATATTGTTGCTTGGGCTCGTTCGATACCAACGATACTTCTGAGTGTTCTTACGAACTATTAAAATTTTAATCTAGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAAGCGATTGTAGTGTATCATCGAATCTTTGAACGCACATGGCGCCTTCAGTATCCTGGGAGGCCGTCGTTTCAACCCTCGAGCCCCAGTGGCCGGTGTTGAGCAGTGGCGGACCCGCGTGGCCCTTCTTGCGTAGTAATTACAGCTCGC>AY555954.1MiddleAsia-Cotton/Gossypiumspp.CCCTTTGTGACCATATTGTTGCTTGGGCTCGTTCGATACCAACGATACTTCTGAGTGTTCTTACGAACTATTAAAATTTTAATCTAGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAAGCGATTGTAGTGTATCATCGAATCTTTGAACGCACATGGCGCCTTCAGTATCCTGGGAGGCCGTCGTTTCAACCCTCGAGCCCCAGTGGCCGGTGTTGAGCAGTGGCGGACCCGCGTGGCCCTTCTTGCGTAGTAATTACAGCTCGC8>AF364014.1Netherlands-Tomato/LycopersiconesculentumCCCTTTGTGACCATATTGTTGCTTGGGCTCGTTCGATACCAACGATACTTCTGAGTGTTCTTACGAACTATTAAAATTTTAATCTAGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAAGCGATTGTAGTGTATCATCGAATCTTTGAACGCACATGGCGCCTTCAGTATCCTGGGAGGCCGTCGTTTCAACCCTCGAGCCCCAGTGGCCGGTGTTGAGCAGTGGCGGACCCGCGTGGCCCTTCTTGCGTAGTAATTACAGCTCGC>AY555953.1UK-Hop/HumuluslupulusCCCTTTGTGACCATATTGTTGCTTGGGCTCGTTCGATACCAACGATACTTCTGAGTGTTCTTACGAACTATTAAAATTTTAATCTAGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAAGCGATTGTAGTGTATCATCGAATCTTTGAACGCACATGGCGCCTTCAGTATCCTGGGAGGCCGTCGTTTCAACCCTCGAGCCCCAGTGGCCGGTGTTAAGCAGTGGCGGACCCGCGTGGCCCTTCTTGCGTAGTAATTACAGCTC>★FJ900212.1USA-Alfalfa/MedicaCCCTTTGTGACCATATTGTTGCTTGGGCTCGTTCTATACCAACGATACTTCTGAGTGTTCTTACGAACTATTCTCTAGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAAGCGATTGTAAATCATCGAATCTTTGAACGCACATGGCGCCTTCAGTATCCTGGGAGGGCGTCGTTTCAACCCTCGAGCCCCAGTGGCCGGTGTTAAGCAGTGGCGGACCCGCGTGGCCCTTCTTGCGTAGTAATTACAGCTC>★GQ336791.1USA-Alfalfa/MedicagosativaCCCTTTGTGACCATATTGTTGCTTGGGCTCGTTCTATACCAACGATACTTCTGAGTGTTCTTACGAACTATTCTCTAGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAAGCGATTGTAAATCATCGAATCTTTGAACGCACATGGCGCCTTCAGTATCCTGGGAGGGCGTCGTTTCAACCCTCGAGCCCCAGTGGCCGGTGTTAAGCAGTGGCGGACCCGCGTGGCCCTTCTTGCGTAGTAATTACAGCTC>★GQ336790.1USA-Alfalfa/MedicagosativaCCCTTTGTGACCATATTGTTGCTTGGGCTCGTTCTATACCAACGATACTTCTGAGTGTTCTTACGAACTATTCTCTAGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAAGCGATTGTAAATCATCGAATCTTTGAACGCACATGGCGCCTTCAGTATCCTGGGAGGGCGTCGTTTCAACCCTCGAGCCCCAGTGGCCGGTGTTAAGCAGTGGCGGACCCGCGTGGCCCTTCTTGCGTAGTAATTACAGCTC9>★GU291258.1USA-Alfalfa/MedicagosativaCCCTTTGTGACCATATTGTTGCTTGGGCTCGTTCGATACCAACGATACTTCTGAGTGTTCTTACGAACTATTAAAATTTTAATCTAGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAAGCGATTGTAGTGTATCATCGAATCTTTGAACGCACATGGCGCCTTCAGTATCCTGGGAGGCCGTCGTTTCAACCCTCGAGCCCCAGTGGCCGGTGTTAAGCAGTGGCGGACCCGCGTGGCCCTTCTTGCGTAGTAATTACAGCTC>★AF364013.1USA-Alfalfa/MedicagosativaCCCTTTGTGACCATATTGTTGCTTGGGCTCGTTCGATACCAACGATACTTCTGAGTGTTCTTACGAACTATTAAAATTTTAATCTAGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAAGCGATTGTAGTGTATCATCGAATCTTTGAACGCACATGGCGCCTTCAGTATCCTGGGAGGCCGTCGTTTCAACCCTCGAGCCCCAGTGGCCGGTGTTAAGCAGTGGCGGACCCGCGTGGCCCTTCTTGCGTAGTAATTACAGCTCCCCTTTGTGACCATATTGTTGCTTGGGCTCGTTCGATACCAACGATACTTCTGAGTGTTCTTACGAACTATTAAAATTTTAATCTAGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAAGCGATTGTAGTGTATCATCGAATCTTTGAACGCACATGGCGCCTTCAGTATCCTGGGAGGCCGTCGTTTCAACCCTCGAGCCCCAGTGGCCGGTGTTAAGCAGTGGCGGACCCGCGTGGCCCTTCTTGCGTAGTAATTACAGCTCCCCTTTGTGACCATATTGTTGCTTGGGCTCGTTCGATACCAACGATACTTCTGAGTGTTCTTACGAACTATTAAAATTTTAATCTAGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAAGCGATTGTAGTGTATCATCGAATCTTTGAACGCACATGGCGCCTTCAGTATCCTGGGAGGCCGTCGTTTCAACCCTCGAGCCCCAGTGGCCGGTGTTAAGCAGTGGCGGACCCGCGTGGCCCTTCTTGCGTAGTAATTACAGCTC>AF364011.1Canada-Alfalfa/MedicagosativaCCCTTTGTGACCATATTGTTGCTTGGGCTCGTTCGATACCAACGATACTTCTGAGTGTTCTTACGAACTATTAAAATTTTAATCTAGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAAGCGATTGTAGTGTATCATCGAATCTTTGAACGCACATGGCGCCTTCAGTATCCTGGGAGGCCGTCGTTTCAACCCTCGAGCCCCAGTGGCCGGTGTTAAGCAGTGGCGGACCCGCGTGGCCCTTCTTGCGTAGTAATTACAGCTC>★AY555955.1USA-Alfalfa/MedicagosativaCCCTTTGTGACCATATTGTTGCTTGGGCTCGTTCGATACCAACGATACTTCTGAGTGTTCTTACGAACTATTAAAATTTTAATCTAGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAAGCGATTGTAGTGTATCATCGAATCTTTGAACGCACATGGCGCCTTCAGTATCCTGGGAGGCCGTCGTTTCAACCCTCGAGCCCCAGTGGCCGGTGTTAAGCAGTGGCGGACCCGCGTGGCCCTTCTTGCGTAGTAATTACAGCTCCCCTTTGTGACCATATTGTTGCTTGGGCTCGTTCGATACCAACGATACTTCTGAGTGTTCTTACGAACTATTAAAATTTTAATCTAGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAAGCGATTGTAGTGTATCATCGAATCTTTGAACGCACATGGCGCCTTCAGTATCCTGGGAGGCCGTCGTTTCAACCCTCGAGCCCCAGTGGCCGGTGTTAAGCAGTGGCGGACCCGCGTGGCCCTTCTTGCGTAGTAATTACAGCTCCCCTTTGTGACCATATTGTTGCTTGGGCTCGTTCGATACCAACGATACTTCTGAGTGTTCTTACGAACTATTAAAATTTTAATCTAGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAAGCGATTGTAGTGTATCATCGAATCTTTGAACGCACATGGCGCCTTCAGTATCCTGGGAGGCCGTCGTTTCAACCCTCGAGCCCCAGTGGCCGGTGTTAAGCAGTGGCGGACCCGCGTGGCCCTTCTTGCGTAGTAATTACAGCTC>KC592083.1Australia-Potato/SolanumtuberosumCCCTTTGTGACCAAATTGTTGCTTGGGCTCGTCCGTTACCAACGATACTTCTGAGTGTTCTTACGAACTATTATCTAGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAAGCGATTGATCATCGAATCTTTGAACGCACATGGCGCCTTCAGTATCCTGGGAGGCCGTCGTTTCAACCCTCGAGCCCTAGAATCAGTGGCGGACCCGCGTGGCCCTTCTTGCGTAGTAATTTTCGCT>DQ825978.1Netherlands-butterbur/PetasiteshybridusCCCTTTGTGACCAAATTGTTGCTTGGGCTCGTCCGTTACCAACGATACTTCTGAGTGTTCTTACGAACTATTATCTAGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAAGCGATTGATCATCGAATCTTTGAACGCACATGGCGCCTTCAGTATCCTGGGAGGCCGTCGTTTCAACCCTCGAGCCCTAGAATCAGTGGCGGACCCGCGTGGCCCTTCTTGCGTAGTAATTTTCGCT>JQ629954.1MiddleAsia-Cotton/Gossypiumspp.CCCTTTGTGACCAAATTGTTGCTTGGGCTCGTCCGTTACCAACGATACTTCTGAGTGTTCTTACGAACTATTATCTAGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAAGCGATTGATCATCGAATCTTTGAACGCACATGGCGCCTTCAGTATCCTGGGAGGCCGTCGTTTCAACCCTCGAGCCCCAGTGGCCGGTGTAATCAGTGGCGGACCCGCGTGGCCCTTCTTGCGTAGTAATTTTCGCTCCCTTTGTGACCATATTGTTGCTTGGGCTCGTTCCATACCAACGATACTTCTGAGTGTTCTTACGAACTACTCTAGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAAGCGATTGTAAATCATCGAATCTTTGAACGCACATGGCGCCTTCAGTATCCTGGGAGGGCGTCGTTTCAACCCTCGAGCCCCAGTGGCCGGTGTTAAGCAGTGGCGGACCCGCGTGGCCCTTCTTGCGTAGTAATTACAGCTC>★JN187990.1USA-Potato/SolanumtuberosumCCCTTTGTGACCAAATTGTTGCTTGGGCTCGTCCGTTTACCAACGATACTTCTGAGTGTTCTTACGAACTATTCTCTAGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAAGCGATTGTAAATCATCGAATCTTTGAACGCACATGGCGCCTTCAGTATCCTGGGAGGGCGTCGTTTCAACCCTCGAGCCCTAGTGGCCGGTGTTAATCAGTGGCGGACCCGCGTGGCCCTTCTTGCGTAGTAATTTTCGCT>HE972035.1Netherlands-Tomato/LycCCCTTTGTGACCATATTGTTGCTTGGGCTCGTTCCATACCAACGATACTTCTGAGTGTTCTTACGAACTACTCTAGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAAGCGATTGTAAATCATCGAATCTTTGAACGCACATGGCGCCTTCAGTATCCTGGGAGGGCGTCGTTTCAACCCTCGAGCCCCAGTGGCCGGTGTTAAGCAGTGGCGGACCCGCGTGGCCCTTCTTGCGTAGTAATTACAGCTC>JN187994.1UK-Potato/SolanumGTAACAAGGTCTCCGTTGGTGAACCAGCGGAGGGATCACTTTGTGAACCAAATTGTTGCTTCGGCGGCTCGTCCATATTTTTACCAACGATACTTCTGAGTGTTCTTACGAACTATTAAAAATCTCTTGGCTCTAGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAACGCGATATGTAAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATGGCGCCTTCCAGTATGCCTGTCCGAGCGTCGTTTCAACCCTCGAGCCCTAGTGGCCCGGTGCTGTAGGCCCTTAAAATCAGTGGCGGACCCGCGTGG>JQ629955.1Netherlands-TomatoTCCGTAGGTGAACCTGCGGAGGGATCATTACCGAGTATCATATTGTTGCTTCGGCGGCTCGTTCTGCGAGCCCGCCGGTACATCAGCAACGATACTTCTGAGTGTTCTTAGCGAACTATTAAATCTAGCACCGATGAAGAACGCAGCGAAACGCGATATGTAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATGGCGCCTTCCAGAGCGTCGTTTCAACCCTCGAGCCCCAGTGGCCCGGTTTAAAAGCAGTGGCGGACCCGCGTGGCCCTTCCTTGCGTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTACCCTTTGTGAACCATATTGTT-GCTTCGGCGGCTCGCTCTTTATTCATACCAACGATACTTCTGAGTGTTCAACGGATCTCTTGGCTCTAGATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATGGCGCCTGAGGCATGCCTGTCCGAGCGTCGTTTCAACCCTCGAGCTACGTCTGTAGGCCCTTAAAAGCAGTGGCGGACCC>HE972033.1UK-Alfalfa/MedicagosativaCCCTTTGTGAACCATATTGTT-GCTTCGGCGGCTCGCTCTTTATTCATACCAACGATACTTCTGAGTGTTCAACGGATCTCTTGGCTCTAGATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATGGCGCCTGAGGCATGCCTGTCCGAGCGTCGTTTCAACCCTCGAGCTACGTCTGTAGGCCCTTAAAAGCAGTGGCGGACCC>HE972032.1USA-Potato/SolanumtuberosumCCCTTTGTGAACCATATTGTT-GCTTCGGCGGCTCGCTCTTTATTCATACCAACGATACTTCTGAGTGTTCTACGGATCTCTTGGCTCTAGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAACGCGATATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACAAGGCATGCCTGTCCGAGCGTCGTTTCAACCCTCGAGCCCCAGTGGCCCGACGTCTGTAGGCCCTTAAAAGCAGTGGCGGACCCGCGTGGCCCTTCCTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAGGGATCATTACCGAGTATCATATTGTTGCTTCGGCGGCTCGTTCTGCGAGCCCGCCGGTACATCACCAACGATACTTCTGAGTGTTCTTAGCGAACTATTAGCTCTAGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAACGCGATATGGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATGGCGCCTTCCCGAGCGTCGTTTCAACCCTCGAGCCCCAGTGGCCCCCCTTAAAAGCAGTGGCGGACCCGCGTGGCCCTTCCCCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTA>JQ629952.1UK-PotatoTCCGTAGGTGAACCTGCGGAGGGATCATTACCGAGTATCATATTGTTGCTTCGGCGGCTCGTTCTGCGAGCCCGCCGGTACATCAGCAACGATACTTCTGAGTGTTCTTAGCGAACTATTAAATCTAGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAACGCGATATGTAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATGGCGCCTTCCAGAGCGTCGTTTCAACCCTCGAGCCCCAGTGGCCCGGTTTAAAAGCAGTGGCGGACCCGCGTGGCCCTTCCTTGCGTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTA>AY536044.1Iran-ACCCTTTGTGAACCATATTGTT-GCTTCGGCGGCTCGCTCTTTATTTATACCAACGATACTTCTGAGTGTTCAACGGATCTCTTGGCTCTAGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAACGCGATATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATGGCGCCTGAGGCATGCCTGTCCGAGCGTCGTTTCAACCCTCGAGCCCCTTTGTGAACCATATTGTT-GCTTCGGCGGCTCGCTCTTTATTTATACCAACGATACTTCTGAGTGTTCAACGGATCTCTTGGCTCTAGATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATGGCGCCTGAGGCATGCCTGTCCGAGCGTCGTTTCAACCCTCGAGCTACGTCTGTAGGCCCTTAAAAGCAGTGGCGGACCC>JQ629950.1Xingjiang,China-Alfalfa/MedicagosativaTCCGTAGGTGAACCTGCGGAGGGATCATTACCGAGTATCATATTGTTGCTTCGGCGGCTCGTTCTGCGAGCCCGCCGGTACATCACCAACGATACTTCTGAGTGTTCTTAGCGAACTATTAGCTCTAGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAACGCGATATGGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATGGCGCCTTCCCGAGCGTCGTTTCAACCCTCGAGCCCCAGTGGCCCCCCTTAAAAGCAGTGGCGGACCCGCGTGGCCCTTCCCCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTACCCTTTGTGAACCATATTGTT-GCTTCGGCGGCTCGCTCTTTATTTATACCAACGATACTTCTGAGTGTTCAACGGATCTCTTGGCTCTAGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAACGCGATATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATGGCGCCTGAGGCATGCCTGTCCGAGCGTCGTTTCAACCCTCGAGCTACGTCTGTAGGCCCTTAAAAGCAGTGGCGGACCCGCGTCCCTTTGTGAACCATATTGTT-GCTTCGGCGGCTCGCTCTTTATTTATACCAACGATACTTCTGAGTGTTCAACGGATCTCTTGGCTCTAGATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATGGCGCCTGAGGCATGCCTGTCCGAGCGTCGTTTCAACCCTCGAGCTACGTCTGTAGGCCCTTAAAAGCAGTGGCGGACCC>DQ825979.1UK-UrtCCCTTTGTGAACCAAATTGTTTGCTTCGGCGGCTCGCTCTATATTTTTACCAACGATACTTCTGAGTGTTCAACGGATCTCTTGGCTCTAGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAACGCGATATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATGGCGCCGAGGCATGCCTGTCCGAGCGTCGTTTCAACCCTCGAGCTACTTCTGTAGGCCCTTAAAATCAGTGGCGGACCCTTTCGCTCGCATCGGAGTCCCGTAGGCACCAGCCTC>AF364016.1Netherlands-S.tubeCCCTTTGTGAACCAAATTGTT-GCTTCGGCGGCTCGTTCTATATTTTTACCAACGATACTTCTGAGTGTTCTTA-CCGGATCTCTTGGCTCTAGCATCGATGAAGAACGCAGCGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCGTTTCAACCCTCGAGCCCTTCTGTAGGCCCTTAAAATCAGTGGCGGACCCGCG>JN188015.1UK-PotatoCCCTTTGTGAACCAAATTGTT-GCTTCGGCGGCTCGTTCTATATTTTTACCAACGATACTTCTGAGTGTTCTTA-CCGGATCTCTTGGCTCTAGCATCGATGAAGAACGCAGCGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCGTTTCAACCCTCGAGCCCTTCTGTAGGCCCTTAAAATCAGTGGCGGACCCGCG>JN188016.1UK-PotatoCCCTTTGTGAACCAAATTGTT-GCTTCGGCGGCTCGTTCTATATTTTTACCAACGATACTTCTGAGTGTTCTTA-CCGGATCTCTTGGCTCTAGCATCGATGAAGAACGCAGCGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCGTTTCAACCCTCGAGCCCTTCTGTAGGCCCTTAAAATCAGTGGCGGACCCGCG>JN188017.1UK-PotatoCCCTTTGTGAACCAAATTGTT-GCTTCGGCGGCTCGTTCTATATTTTTACCAACGATACTTCTGAGTGTTCTTA-CCGGATCTCTTGGCTCTAGCATCGATGAAGAACGCAGCGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCGTTTCAACCCTCGAGCCCTTCTGTAGGCCCTTAAAATCAGTGGCGGACCCGCG>KC592084.1Australia-PotCCCTTTGTGAACCAAATTGTT-GCTTCGGCGGCTCGTTCTATATTTTTACCAACGATACTTCTGAGTGTTCTTA-CCGGATCTCTTGGCTCTAGCATCGATGAAGAACGCAGCGGGCATGCCTGTCCGA