DB37-T 4724-2024 驴驹大肠杆菌病防治技术规程

65.020.30CCS

B

4437 DB37/T

4724—2024驴驹大肠杆菌病防治技术规程Code

of

practice

the

of

in

donkey

foals山东省市场监督管理局 发

布DB37/T

4724—2024 本文件按照GB/T

—《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由山东省畜牧兽医局提出并组织实施。本文件由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。DB37/T

4724—20241 范围害驴处理和档案管理。本文件适用于养驴场驴驹大肠杆菌病的防治。2 规范性引用文件文件。GB

19489实验室生物安全通用要求GB

39707 医疗废物处理处置污染控制标准NY/T

畜禽场环境质量标准NY/T

兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范NY

5027 无公害食品 畜禽饮用水水质NY/T

5030 无公害农产品 兽药使用准则3 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.13.2 驴驹大肠杆菌病 donkey

foals

colibacillosis由O78、O101、O8等主要血清型的致病性大肠杆菌引起驴驹的急性、接触性传染病。4 流行病学4.1 病原特点病原为肠杆菌科大肠埃希氏菌属中O78、O101、O8等主要血清型的致病性大肠杆菌。病原菌为革兰氏阴性菌，在驴驹肠道及其粪便污染的环境中广泛存在。4.2 传染源发病驴驹和携带致病性大肠杆菌的驴。4.3 传播途径该病通过消化道传播，粪-口传播是主要途径。病原菌污染粪便、圈舍、饲料、水槽及饮水等均可传播。可通过脐带或分娩时经产道传播。DB37/T

4724—20244.4 易感动物8月龄内的驴驹均可发病，多于出生后2

d～3

d发病。4.5 发病特点1

d～2

d5%～为2%～20%。5 临床症状粪便，呈黄色、白色或灰白色，有时含多量黏液或血液，腥臭味。发病中期出现衰弱，脱水，喜躺卧，无法站立。发病末期，食欲废绝，腹泻和便秘交替发生，由败血症和全身微循环衰竭致死。6 病理变化胃黏膜脱落，有出血点和出血斑。小肠、盲肠和结肠表现为黏膜脱落。肝脏肿大、淤血。脾肿大，包膜下有出血点。心内膜和外膜也有出血点，肠系膜淋巴结肿大、出血。7 诊断7.1 临床诊断步临床诊断。7.2 实验室诊断见附录A。7.2.1 采样按NY/T

541的规定执行，主要采集肛拭子、腹泻物等病料。7.2.2 细菌分离培养

℃恒温培养24

h形菌落。挑取符合大肠杆菌特征的单菌落纯化34次。7.2.3 显微镜检将单菌落革兰氏染色，镜检，油镜下呈现两端钝圆，单在或成对的革兰氏阴性菌。7.2.4 生化鉴定将纯化后的细菌接种于葡萄糖、甘露醇、乳糖、麦芽糖、吲哚试验、试验、甲基红试验、枸橼酸盐试验管，37

℃恒温培养24

h麦芽糖产酸产气、吲哚试验和甲基红试验呈阳性，试验和枸橼酸盐试验呈阴性。7.2.5 大肠杆菌

O

血清型鉴定DB37/T

4724—2024将纯化的大肠杆菌接种于固体培养基上，

℃培养24

h0.5%浓稠悬液，经121

℃高压2

h，制备O抗原。取洁净玻片，吸取O抗原滴于玻片两端，一滴加入10

μL抗O301

minA.1进行判定，出现“++”及以上凝集反应判定阳性结果。7.2.6 分离菌株

rDNA

序列测定提取分离菌基因组为模板扩增

rDNA序列。引物序列按照附录A。PCR反应体系为模板（基因组DNA20

μL～50

ng/μL）2

μL，2×

PCR

Mix

12.5

μL，上下游引物（20

μmol/L1

μL，2O

μL，共25

μL反应体系。反应程序为95

℃预变性5

；95

℃变性15

s，53

℃退火15

s，72

℃延伸2

min30个循环；最终72

5

，4

℃暂时保存。通过1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。片段大小约为1

500

。回收并纯化产物，按照双脱氧链终止法测序。7.3 结果判定将PCR测序结果使用NCBIBLAST断结果确诊该病。7.4 实验室生物安全按照GB

19489规定执行。8 预防8.1 环境卫生按NY/T

388和NY

5027的规定执行。夏季食槽和水槽应及时清理。8.2 生物安全8.3 管理8.3.1 妊娠母驴做好孕驴产前和产后护理工作,

时清理胎衣和其它排泄物并彻底消毒。寒冷季节做好产房保温。8.3.2 驴驹驴驹应做好保暖工作。8.4预防措施根据流行病学调查结果，发病率高驴场，在分娩前3

d～5

d给予母驴微生态制剂或中兽药。9 治疗DB37/T

4724—20249.1 原则9.1.1口服、注射方式投入兽药应符合

NY/T

5030

的要求。9.1.2 抗菌药物的使用应根据实验室药敏试验结果，科学规范使用。9.2方法采用对因治疗和对症治疗。推荐药物见附录B。10 病死驴及病害驴处理10.1 病死驴及病害驴的处理见《病死及病害动物无害化处理技术规范》（农医发[2017]25

号）的规定。10.2 废弃物与病料处理按照

39707

规定执行。11 档案管理11.1 记录日期、剂量、疗程、消毒、免疫、实验室检测结果、疗效及停药时间。11.2 存档各种记录保存期限不低于两年，分类归档。所需要的特异性DNA片段，而且扩增的片段以2

的方式倍增。DB37/T

4724—所需要的特异性DNA片段，而且扩增的片段以2

的方式倍增。

附录 A（规范性）主要实验室诊断方法A.1原理A.1.1 麦康凯选择培养基：大肠杆菌发酵乳糖产酸，PH值降低，麦康凯平板中的显色剂（中性红）显红色，同时有胆盐沉淀呈现粉色。A.1.2 革兰氏染色：G+菌：细胞壁厚，肽聚糖网状分子形成一种透性障，当乙醇脱色时，肽聚糖脱水而孔障缩小，故保留结晶紫-碘复合物在细胞膜上。呈紫色。Gˉ菌：肽聚糖层薄，交联松散，乙醇脱色不能使其结构收缩，其脂含量高，乙醇将脂溶解，缝隙加大，结晶紫-碘复合物溶出细胞壁，沙黄复染后呈红色。A.1.3 大肠杆菌O原与抗体结合时，它们之间的亲和力会导致免疫复合物的形成，从而引起凝集反应。A.1.4PCR反应：聚合酶链反应（PCR）是年代中期发展起来的分子生物学技术。其基本原理是用两DNAnA.1.5琼脂糖凝胶电泳实验：凝胶电泳的原理是基于DNA分子的电荷和大小差异。分子是带有负电荷的，因此可以在电场中移动。凝胶是一种具有微孔结构的材料，可以限制分子的运动，使其只能通过微孔的大小进行分离。A.2 试剂或材料A.2.1无菌棉签。A.2.2 生理盐水。A.2.3 麦康凯固体培养基。A.2.4 无菌培养皿。A.2.5 革兰氏染色试剂盒。A.2.6 载玻片。A.2.7 无菌试管。A.2.8 营养肉汤液体培养基。A.2.9 LB液体培养基。A.2.10 细菌基因组提取试剂盒。A.2.11 琼脂糖。A.2.12 TAE缓冲液。A.2.13 DNA纯化试剂盒。A.2.14 PCR

A.2.15 ddH2O。A.2.16 无菌移液器枪头（10

μL、200

μL、1

μLDB37/T

4724—2024A.2.17 2

mLEP管。A.2.18 PCR反应管。A.3 仪器设备A.3.1 高速冷冻离心机：最大速度：14

800转每分，最大：21

100

x

g，温度范围：-9

℃～

A.3.2 细菌培养箱：温度范围

℃～

A.3.3医用冰箱：冷藏室温度范围：2

℃～8

℃，冷冻室温度范围：

A.3.4 超低温冰箱：温度范围

℃～

A.3.5 PCR扩增仪。A.3.6 核酸电泳仪。A.3.7 RT+5

℃～60

0.5

A.3.8 正置显微镜。A.4 试验步骤

℃温箱培养24

h34钝圆，单在或成对的革兰氏阴性菌。将纯化后的细菌接种于葡萄糖、甘露醇、乳糖、麦芽糖、吲哚试验、试验、甲基红试验、枸橼酸盐试验管37

℃恒温培养24

h后观察。将纯化的大肠杆菌接种于固体培养基上，

℃培养24

h0.5%浓稠悬液，经121

℃高压2

h，制备O抗原。取洁净玻片，吸取O抗原滴于玻片两端，一滴加入10

μL抗O血清，一滴加入等量生理盐水。轻轻晃动玻片，倾斜玻片°于1

内观察试验现象，根据试验现象和表，判断试验结果。2 2将纯化的大肠杆菌接种于液体培养基中，置37

℃恒温摇床中培养20

h，提取分离菌基因组2 2模板扩增

rDNA序列。DNA20

μL～

ng/μL）

μL，×

MasterMix

12.5

μL（5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'）；1492R（5'-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3'）各1

μL，2O

μL25

μL反应管内并混匀。PCR反应程序为℃预变性5

；

℃变性

s，53

℃退火

s，72

℃延伸2

min，共个循环；最终72

℃延伸5

min，4

℃暂时保存。通过1%琼脂糖凝胶经核酸电泳仪电泳鉴定。根据目的片段回收并纯化PCR序。A.5数据处理将PCR测序结果使用NCBIBLAST进行检索。表A.1表A.1

O

血清型鉴定判定标准DB37/T

4724—2024

附 录B（资料性）推荐治疗方法B.1 对因治疗根据药敏试验结果选择合适药物。消化道给药：口服或灌肠庆大霉素，磺胺脒等敏感药物。制剂、钾制剂和维生素，调整胃肠机能。冬季补液应加温。B.2 对症治疗对症