(高清版)GBT 41915-2022 纳米技术 MTS法测定纳米颗粒的细胞毒性

国家市场监督管理总局国家标准化管理委员会I Ⅲ 1 1 1 25材料 25.1细胞系 25.2检测 3 36仪器 3 38准备 48.1概述 4 4 48.4验证细胞生长状态 4 58.6准备对照实验 58.6.1对照实验说明 5 58.6.3纳米颗粒对照悬浮液的制备 5 6 6 6 6 7 9 99.6测量甲瓒的吸光度 9 9 附录A(规范性)可供选择的细胞系和检测方法 Ⅱ 24Ⅲ米材料对人类健康和环境可能造成潜在风险的疑虑也在不断上升。目前国际上正在开展大量的相关研化学品也可能影响纳米颗粒与细胞之间的相互作用。特别是考虑到纳米颗粒比表面积大的特点，这一细胞是生命的基本单元。监测纳米颗粒暴露后模式细胞的生物响应有望加深我们对纳米颗粒“作案在任何实验室均可重复。IANH通过几种常见米材料与细胞的体外相互作用进行了比对实验(附录A)。该联盟明确了一些会增加数据波动的因素，并发展了降低数据波动性的技术。美国国立卫生研究院国家环境卫生科学研究所(NIEHSNanoGo)资助的研究进一步评价了部分测试方案，尤其苯基)-2-(4-磺基苯基)-2H-四唑(MTS)的检测方案。第三个团队扩展了IANH的方法并采用统一设计的多孔板进行实验，提高了分析结果的一致性(附录B)[5]。尤其重要的是上述项目都是采用多个实本文件采用MTS法评估体外细胞的活力6]。该方法利用孔板中胞浆还原酶催化生成的甲膜(吸收峰位于490nm)产生显色反应。通常情况下，吸光度的变化与细胞数成正比关系。但检测过程中改变了还原酶活性或者反应试剂不足量也可能导致显色反应，导致吸光度与细胞活力(如细胞数)不成正比关系。将MTS试剂直接添加到细胞培养板中，可以快速评估纳米颗粒的潜在内毒性。由于纳米颗常重要。在显微镜下直接观察处理后的细胞是一个验证MTS检测结果的正交方法。本文件提出的规本方法中纳米颗粒对单独细胞系影响的毒性检测为初级检测。本文件提出的标准方法基于上述3种MTS分析方案。实验体系的区别见表1。表1用于制定标准化MTS分析方案的研究总结发起机构细胞系阳性和阴性对照材料是否离心十PS-NP,CeO₂CdSO₄,无颗粒暴露否BEAS-2B、RLE-6TN和THP-1是十PS-NPCdCl₂,无颗粒暴露否·+PS-NP为带正电PS纳米颗粒，CeO₂为二氧化铈，ZnO为氧化锌，TiO₂为二氧化钛，MWCNT为多壁碳纳V需要进行对照实验，以确定未经处理细胞的细胞值得注意的是，这里描述的MTS法是用于评估纳米材料细胞毒性的诸多商业方法之一。虽然本1GB/T41915—2022/IS本文件描述了用于评价纳米物体及其聚集体和团聚体(NOAA)对细胞活力影响的MTS方法。此本文件适用于96孔板。下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文ISO/TS80004-2纳米科技术语第2部分：纳米物体(Nanotechnologies—Vocabulary—本文件使用的是96孔组织培养级孔板。2按照GB/T16886.5试验时可再现细胞毒性反应的材料。沉降sedimentation分散相因其中分散颗粒的密度高于连续相发生的下试验样品testsamplecells/mL:单位毫升体积中的细胞数(cellspermillilitre)ylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetraPS:聚苯乙烯(polystyrene)5材料首选已建立的细胞系，使用时应从有资质的细胞库中获取。用MTS法测定纳米颗粒的细胞毒性如果需要对细胞系进行储存，应在-80℃或更低温度下使用相应的培养基储存，且培养基中应含有冷冻保护剂，如二甲基亚砜或甘油。只能在-130℃或更低温度下长期储存(几个月甚至长达几年)。35.2.1MTS\PMS[CAS#138169-4试剂在细胞酶的作用下被还原成可溶于培养基的显色产物。在没有人为污染的情况下，培养基的光密度值与培养容器中的细胞数量相关。如果培养条件影响细胞内的还原酶活性，或纳米颗粒在检测5.3对照基亚砜等非金属化学品和吐温80等洗涤剂可作为化学阳性对照，但其作为阳性5.3.2带正电的PS纳米颗粒，(直径60nm分散于水中)应作为纳米颗粒阳性对照材料。该颗粒已在实验室间比对证实可用作A549和Raw264.7细胞的阳性对照(见表1)。6仪器6.1培养箱，37℃±1℃,加湿，5%CO₂/空气。6.2平底96孔板。6.3U形底96多孔板(作为加样板使用)。6.4平底24孔板(仅用于细胞培养和增殖)。6.596孔板酶标仪。6.6加速度至少2000g的离心机。6.7200μL的多通道移液器(至少8个通道)。样品制备的基本原则是使用可重复的操作步骤，将纳米颗粒分散在生物相容的液体中。这些操作4白蛋白，再进行分散，或直接将其分散于含血清的培养基中。有关分散性的详细信息，参见注释和如果纳米颗粒是分散在水等液体介质中，所加介质的体积在细胞培养基中的体积分数应低于其产纳米颗粒悬浮液的液体介质可能对细胞产生毒性并引起假阳性毒性结果。应使用液体介质进行对a)抗聚集的稳定性(反映在平均颗粒尺寸上);b)胶体悬浮液的稳定性(反映在沉淀和沉8准备培养基中无论有无血清都应满足所选细胞的生长要求。如果抗生素对检测没有影响，可在培养基信息见附录A.56)用体视显微镜记录细胞的状态和形貌。1)轻吸除去孔中的培养液；2)按照厂家说明书收集细胞；3)将含有细胞的培养基加入离心管中；5)弃去上清液；6)在100pL培养基中，加入25μL含0.4%台盼蓝的PBS溶液；8)将细胞悬液滴在细胞计数器上；的细胞活力应大于5%。b)将10mmol/L的CdSO₄保存在4℃,无需无菌过滤。6应使用经过校准的移液器在96孔板上移取试剂。如果可能，宜用校准过的多通道移液器进行实验，如至少带有6个枪头的移液器。之前的研究表明用多通道移液器进行细胞接种引起的差异比用单9表征纳米颗粒对细胞活力的影响由于纳米颗粒悬浮液可能产生变化，不同时间的3次重复实验应用新配的纳米颗粒悬液。实验流程如图1所示。潜在干扰形态7——一个培养板需要准备1000000个细胞(约30%过量)。9.2.2将含细胞的完全培养基(200μL)转移到第3列～第6列和第8列~第10列的每个孔内，如图29.2.3将不含细胞的完全培养基(200μL)转移到第2列、第7列、第11列的每个孔内(斜杠区),如图2所示。每个清亮的孔中接种细胞的密度为1.5×10⁴个细胞/孔。第2列、第7列、第11列中只有培养a)孵育24h±2h;9.3.1图3是加样板的基本设置。第6列和第7列为细胞培养基+1%H₂O。第2列～第5列和第8列～第11列分别为阳性对照材料和不同剂量的纳米颗粒测试样品。第2列和第11列则为阳性化学品和纳米颗粒测试样品的干扰列。样品体积见表2。用8通道移液器将每孔中对应的培养液转移到培养8不含细胞不含细胞不处理不处理重复测试1重复测试2重复测试3不含细胞AHBCDEFG26注：图3中纳米颗粒质量分数指第7章的带正电的PS纳米颗粒的悬浮液。当其他纳米颗粒需要配制成更高质量分数时，可参照第7章中的建议，以确定纳米颗粒悬浮液在每个剂量组的加入量及分散溶剂的最高质量分数。a)参照表2中给出的配制剂量将CdSO₄加入到第2列～第5列中；b)参照表2中给出的配制剂量将带正电的PS纳米颗粒或纳米颗粒测试样品加入到第8列～第11列中；c)第6列和第7列各加入含1%H₂O的培养基200μL。注1:培养基中1%的H₂O含量取决于纳米颗粒储备液的浓度，参见第7章的建议。注2:在将细胞培养板从培养箱取出前约3h,制备纳米颗粒加样板。这样可以保证将细胞上的培养基去除后即可加入含不同剂量的纳米颗粒细胞悬液到培养板中，减小了纳米颗粒长时间悬浮在培养基中发生沉淀带来的影响。表2加样板中培养基、化学药品、纳米颗粒的剂量配比行序号第2列～第5列和第2列和第3列中CdSO₄(100mmol/L)在完全细胞第4列带正电的PS(1%悬浮浓度)在完全B000C222DEFG099.4.2用200μL移液器(如多通道移液器)将加样板中样品转移到细胞培养板上。9.4.3将细胞培养板置于培养箱孵育24h。9.6.2用酶标仪测定在490nm处的吸光度。a)将培养液中纳米颗粒的平均背景水平吸光度(第11列)从每个孔中减去。b)将每个加样复孔测得的吸光度对未处理孔(B行)的吸光度进行归一化。这些去掉背景和归一c)归一化后，算出同一加样组(第3列～第5列和第8列～第10列)中该剂量细胞活力的平均值d)如果测到细胞毒性，用Graph(资料性)本草案是附录C中未经同行审阅的IANH草案的扩展。本草案包括加样板制备和更多细胞处理的具体细节。A549细胞被用于评估带正电的PS纳米颗粒和二氧化铈纳米颗粒的细胞毒性效应。使用该方案在5个国际测量实验室进行了实验室间比对。具体实验设计见参考文献6]。比对结果汇总在附录B最后。与NanoGo草案区别之处是本草案未使用离心步骤来降低纳米颗粒可能产生的干扰。B.2实验步骤用本草案的修订版评估纳米颗粒对A549细胞的毒性效应。B.2.2材料B.2.2.2检测B.洛斯维帕克纪念研究所培养B.青霉素。B.链霉素。B.无酚红的DMEM。B.2蒸馏水或任何适合细胞培养B.3两性霉素B(抗真菌剂)。见第6章。B.3.1概述B.3.2培养基B.3.2.1完全培养基B.10%胎牛血清(FBS)。B.2.5μg/mL两性霉素B。由于L-谷氨酰胺可能会降解，培养基的储存时间不应超过3周。标记清楚收到培养基的时间和进B.洛斯维帕克纪念研究所培养基(RPMI-1640)。B.3.3细胞培养B.3.3.1细胞复苏一旦复苏，在实验之前细胞要传代至少两次。细胞传代培养不应超过3个月。用20mL完全培养基将细胞培养在一个75cm²培养瓶中放置在标准培养条件下(37℃,5%GB/T41915—2022/ISO19B.加入2mL0.05%胰蛋白酶-EDTA且在37℃,5%CO₂的条件下孵育3min。B.晃动培养瓶使细胞从壁上脱落下来并转移细胞。B.往培养瓶中加入20mL完全培养基，并吹洗培养瓶3次～5次，转移细胞。B.3.3.4计数细胞确定细胞的健康状态B.用吸管将约20mL的细胞悬液(2mL胰蛋白酶-EDTA+18mL的完全细胞培养基)加入到50mL的锥形管中。B.在200g,5min离心细胞悬浮液，以沉淀细胞。B.去除上清，添加约1mL培养基并重悬细胞。用200μL的移液器将溶液混匀。计数板的一端加入。尽量避免血球计数板和盖玻片间产生气泡，见图B.1。AB用图B.1血球计数板示意图(细胞计数室)B.血球计数仪板共有8个正方形计数室，数角上(图B.1中的A1、A3、A7、A9、B1、B3、B7和B9)4个1mm²正方形上的所有细胞数(染上蓝色代表死细胞，活细胞没有颜色)。如果超过25%的细胞死亡，细胞状态不好。应丢弃当前的细胞悬液，重新养细胞。B.用以下公式计算每单位体积中细胞的数目(cells/mL):细胞数=平均细胞数×稀释倍数×10⁴/mL。B.4.1接种细胞B.4.1.1对于1个96孔板需将7.5×105个细胞(7.5×104cells/mL)重悬于10mL完全培养基中。B.4.1.2在第3列～第6列和第8列～第10列的蓝色孔中(见图2),每孔接种细胞1.5×10⁴c/w每个蓝色孔中加入含细胞的200μL完全培养基，细胞接种密度为每B.4.1.3接种好细胞的96孔板需在37℃、5%CO₂的加湿培养箱中培养24h。将240μL无菌水(双蒸水)与23.76mL无血清培养基混合。得到的混合物(1)将用于制备下列不同a)40μL10mmol/mLCdSO₄与3960μL的混合物(1b)2000μL100μmol/mLCdSO₄与2000μL的混合物(1)混合=>50μmol/mLCdSO₄;c)2000μL50μmol/mLCdSO₄与2000μL的混d)2000μL25μmol/mLCdSO₄与3000μL的混合物(1)混合=>10μmol/mLCdSO₄;a)4μL10%PS-NH₂与3996μL的(2)混合=>100μg/mLPS-NH₂;f)培养基(2)被作为0(g/mLPS-NH₂。B.4.3.1将装有10%PS-NH₂和溶剂的试管放到涡旋振荡器涡旋。B.4.3.2得到的含纳米颗粒的混合物在进一步稀释前或细胞前处理前也需涡旋混匀。—2×4pL10%PS-NH₂与2×3996μL的(2)混合=>100μg/mLPS-NH₂;B.4.4分别用对照药品和纳米颗粒处理A549细胞B.4.4.1去除第2列～第5列和第8列～第11列孔中的培养基上清液。B.4.4.2用PBS清洗：往第2列~第5列和第8列～第11列的每孔中加入200μLPBS,再吸出，重复3次。B.4.4.3第8列～第11列按图B.3所示的培养板布局加入不同浓度的纳米颗粒。B.4.4.4第2列～第5列按图B.3所示的培养板布局加入不同浓度的对照药品。B.4.4.5处理后的96孔板需在37℃、5%CO₂的加湿培养箱中培养24h。的移液器(200μL)按列给第8列～第11列和第2列～第5列加对应药品。a)2.5mLMTS试剂与12.5mL的RPMI-1640(无酚红)混合。得到的混合物称为(3).RPMI-对照范围药品对照组背景'(B2-G2孔)CdSO,对照组(ECs。值，B3-G5孔)移液器自身造成的差异(B6-G6孔)无细胞对照和无处理对照(B7-G7孔)纳米颗粒背景(B11-G11孔)移液管之间的差异(B3-B5孔，B8-B10孔)化学试剂对照没有引入额外背景。未给出相关数值，因为有一些实验室观测了背景信号而有些没有观测。X00◆实验室1器实验室2X实验室4+PS-NP的剂量浓度(μg/mL)图B.45个实验室在含血清培养基中将A549细胞暴露于+PS-NP后得到的剂量-效应曲线(资料性)案例：基于Raw264.7细胞系的MTS法C.1概述轮比对。该草案使用Raw264.7细胞系验证细胞的生长率和活力，进而评估带正电的PS纳米颗粒和C.2实验步骤C.2.1基本步骤C.2.1.1概述Raw264.7细胞的健康和生长率按本文件中的8.4验证。纳米颗粒对Raw264.7细胞的毒性效应按本文件中第9章和第10章进行确定。C.检测C..8磷酸盐缓冲液(PBS)(不含Ca²+和Mg²+)。C..9无酚红的DMEM。C..12带正电的PS纳米颗粒(直径小于100nm)(阳性对照)[13]。C..13蒸馏水或任何适合细胞培养的纯化水。见第6章。C.3准备工作C.3.1概述C.3.2培养基—10%胎牛血清(FBS);——100μg/mL链霉素；——2.5pg/mL两性霉素B。C.3.3细胞培养C.将培养基(含10%FBS)加入离心管中，并放在冰上，使其冷却C.将吸出的细胞加入含有培养基的15mL离心管中。C.在15mL离心管中用培养基(含10%FBS)重悬细胞。C.7400g离心5min,再去除培养基。C.每2天～3天用培养基洗一次细胞并换液。75cm²的培养瓶用15mL培养基(含10%FBS)或25cm²的培养瓶加5mL培养基。C.在传代前，细胞要在37℃、5%CO₂的条件下生长2天～3天。Raw264.7细胞会贴壁生长到培养瓶上。将细胞按2×10⁵cells/mL的密度分散在无酚红培养基中(含10%FBS)。■研究小组6■研究小组1■研究小组2■研究小组3GB/T41915—2022/ISO190070研究小组3没有测量24h的细胞活力。大多数研究小组报道，24h和48h的细胞活力均在90%C.4.1带正电的PS纳米颗粒和二氧化铈纳米颗粒及Raw264.7细胞按第9章操作。C.4.2按第10章中的程序进行细胞毒性分析。C.5纳米颗粒暴露对Raw264.7细胞活力的影响和C.4所示。但Raw264.7细胞暴露于二氧化铈纳米颗粒(200nm)不引起细胞活力下降，而导致吸光细胞活力/%GB/T41915—2022/ISO19细胞活力/%一实验室4一实验室5一实验室6实验室7实验室8“实验室9实验室10实验室1一实验室2→实验室3暴露剂量(μg/mL)0图C.4带正电的PS纳米颗粒作用Raw264.7细胞24h后的细胞活力10个研究小组均发现作用24h后随着暴露剂量的增加细胞活力下降，但实验数据的离散度很大。0暴露剂量(μg/mL)实验室1实验室2实验室3一一实验室4一实验室6一实验室7一实验室8一实验室9实验室10图C.5200nm的二氧化铈纳米颗粒作用Raw264.7细胞24h后的细胞活力10个实验室均发现作用24h后随着暴露剂量的增加细胞活力没有下降，但实验数据的离散度很大。[1]GB/T16886.5—2017医疗器械生物学评价第5部分：体外细胞毒性试验[2]GB/T41309—2022纳米技术纳米材料的内毒素体外测试鲨试剂法[3]ISO/TS19337Nanotechnologies—Characteristicsofworkingsuspen[4]XIAT.,HAMILTONR.F.JR,BONNERJ.C.,CRANDALLE.D.,ELDERLAHIF.InterlaboratoryEvaluationofinVitroCytotoxicityandInflammatoryResponsestoEngi-neeredNanomaterials:TheNIEHSNanoGoConsortium.Environ.HealthPerspect.2013,121pp.683—690[5]ELLIOTTJ.T.,RÖSSLEINM.,SONGN.W.,TOMANB.,KINSNER-OVASKAINENA.,MANIRATANACHOTER.,SALITM.L.,PETERSENE.J.,SEQUEIRAF.,LEEJ.,KIMF.ROSSI,S.J.,HIRSCH,C.,KRUG,H.F.,SUCHAOIN,W.,ANDWICK,P.TowardAchievingHarmonizationinaNano-cytotoxicityAssayMeasurementthroughanInterlaboratoryComparisStudy.ALTEX.2016S[6]CORYA.H.,OWENT.C.,BARLTROPJ.A.,CORYJ.G.Useofanaqueourazolium/formazanassayforcellgrowthassaysinculture.CancerComm[7]MOSSMANT.Rapidcolorimetricassayproliferationandcytotoxicityassays.J.Immunol.Methods.1983,65pp.55—63[8]ROEHMN.W.,RODGERSG.H.,HATFIELDS.M.,GLASEBRcolorimetricassayforcellproliferationandviabilmunological.Methods.1991,142pp.257—265[9]CHOKSAKULNIMITRS.,MASUDAM.Invitrocytotoxicityofmacromoleculesindifferentcellculturesystems.J.Control.Rele[10]STROBERW.TrypanBlueExclusionTestofCellViability.CurrentProtocnology.A.3B.1—A.3B.2.(2001):Altman,S.A.,Randers,L.andRao,G.ComparisonoftrypanbluedyeexclusionandfluorometBiotechnol.Prog.1993,9pp.671—674turesforcytotoxicityassays(HTD/NR-90).J.TissueCult.Methods.1985,9pp.7—9[12]XIAT.,KOVOCHICHM.,LIONGM.,MÄDLERsonoftheMechanismofToxicityofZincOxideandCeriumOxideNanoparticlesBasedonDissolutionandOxidativeStressProperties.ACSNano.2008,10pp.2121—2134[13]XIAT.,KOVOCHICHM.,LIONGM.,ZINKJ.I,NELnanospheretoxicitydependsoncelspecificendocyticandmitochondriNano.2008,2pp.85—96[14]GUADAGNINIR,HALAMODAKENZAOUIB,WALKERL,PLENOVAZ,BILANICOVAD,SAUNDERSM,JUILLERAT-JEANNERETL,MARCOMIBOLM,MARANOF,BOLANDS.Toxicityfnanomaterials:challengesduetointerfeonGoodCellCulturePractice,ATLA,33,pp.261—287,2005;Freshney,R.I.(1AnimalCells,AManualofBasicTechnique,3rded.,NewYork:Wiley-Liss[16]VALLEEB.L.,&ULMERD.D.BiochemicaleffectsofMercury,Cadmium,aLead.AnnualReviewsofBiochemistry,41,pp.91—128,1972;Stohs,S.J..Bagchi,D.,Hassoun,E.andBagchi,M.OxidativeMechanismsintheToxicityofChromiumandCadmiumIons.JournalofEnvironmentalPathology,ToxicologyandOncology,20,Issue212pages,2001[17]XIAT.,KOVOCHICHM.,BRANTparisonoftheabilitiesofambientandmanufacturednanoparticlestoanoxidativestress