(高清版)GBT 42216.1-2022 分子体外诊断检验 福尔马林固定及石蜡包埋组织检验前过程的规范 第1部分：分离RNA

国家市场监督管理总局国家标准化管理委员会I Ⅲ 1 1 1 4 55.1标本采集 5 6 66.1关于标本接收的信息 66.2标本/样品的福尔马林固定 7 7 8 86.6处理及石蜡包埋 86.7贮存要求 96.8RNA的分离 9 6.10RNA的贮存 附录A(资料性)基于RT-qPCR对从福尔马林固定和石蜡包埋(FFPE)组织样品分离的RNA进行质量控制 Ⅲ程的规范第1部分：分离RNA》。 11范围本文件提供了在进行分子分析之前的检验前阶段，用于RNA检验的福尔马林固定和石蜡包埋组本文件适用于分子体外诊断检验，包括医学实验室和分子病理学实验室下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不GB/T22576.1—2018医学实验室质量和能力的要求第1部分：通用要求(ISO15189:2012,GB/T27020—2016合格评定各类检验机构的运作要求(ISO/IEC17020:2012,IDT)ISO15189医学实验室质量和能力的要求(Medicallaboratories—RequirementsforqualityISO15190医学实验室安全要求(Medicallaboratories—Requirementsforsafety)ISO15189界定的以及下列术语和定义适用于本文件。2GB/T42216.1—2022/ISO20166-1:2018互补DNA在逆转录酶存在下合成的与给定的RNA互补的单链DNA,作为合成DNA拷贝的模板。术语]质量分数为37%的饱和甲醛水溶液(相当于体积分数40%)。大体检查grossing,grossexamina3定义]原始样品primarysample标本specimen核糖核酸ribonucleicacid;RNA催化RNA降解成更小组分的酶。本文件中是指18℃~25℃。样品sample45物分子稳定性和样品贮存条件。应记录不能完全控制的工作流程步骤(如热缺血)运送到实验室的过程),应记录其持续时间和标本容器周围的温度。当标本被运致从FFPE组织中分离的RNA不能达到最佳分析测试性能(参见A.2.1和A.2.2)。这宜在分子分析cDNA靶分子大小和/或影响用于结合的cDNA靶分子的扩增引物序列。可通过优化FFPE组织分析关于运送和处理的安全说明应符合GB/T22576.1—2018中5.2.3和5.4.5以及ISO15190的文件记录应包括标本供体/患者身份信息(ID)等);c)标本供体/患者相应的知情同意。6GB/T42216.1—2022/ISO20166-1:2018a)通过记录缺血相关的血管结扎/夹闭时间点(通常为动脉夹闭时间)来表示体内缺血开始(热缺血);d)6.2要求记录的步骤信息(适用于福尔马林固定始于实验室外部),6.3要求记录的步骤信息文件记录还宜包括负责收集标本的人员ID。c)选择和使用稳定程序进行运送(如冷却);标本离体后，宜立即转移到容器中。容器宜置于冰上或维持温度在2℃~8℃,最大限度地减少范围宜按环境温度、室温或2℃~8℃进行大致分类。如果标本尚未放入标准缓冲福尔马林溶液中，宜立即置于冰上或维持温度在2℃~8℃下进行即6实验室内部7GB/T42216.1—2022/ISO20166-1:2018本程序适用于标本和从一个标本中取出的一个或多个部分得到的由于福尔马林不稳定(如甲醛可以氧化为甲酸),宜每周至少检查一次标准缓冲福尔马林溶液的pH,并在使用前或更换新批次时都检查其pH[16]。b)记录将组织标本/样品放入标准缓冲福尔马林溶液1)容器的容量宜保证标本可以完全浸没在标准缓冲福尔马林溶液中。标准缓冲福尔马林溶液用量与组织的最小比例取决于相关组织，但宜至少为10:1(体积比)。对于较大的标2)使用预先装满标准缓冲福尔马林溶液的容器时，应遵循供应商的产品说明。3)容器应能安全关闭。1)患者/捐赠者ID、唯一的标本/样品ID和采集的日期，这些都能以代码的形式呈现(每个样品的代码都是唯一的);2)基本的标本信息，如组织类型、组织状态和相关的附加影响信息(如是否受肿瘤影响),除非上述信息在样品追踪系统能与6.2d)1)使用的标本/样品标识关联获得；3)每个容器的唯一编号可包含在6.2d)1)中。宜考虑在某些疾病条件下(如肿瘤),分子特征可能不会均匀地在组织标本/样品中呈现。因此，由具有资质的病理医师对分子检验实际使用的组织标本/样品进行评估是非常重要的(参见6.3)。在这种情况下，宜记录实际上用于分子检验的组织标本/样品的疾病特征(如不同的分子机制能在肿瘤的中心标本病理学的评估和记录以及从标本中选择用于进一步处理的样品应由具有医师资质的病理医师8GB/T42216.1—2022/ISO20166-1选择用于RNA检验的样品。取合适的标本部分，以确保用于RNA检验的样品采集不会影响组织病理学检验。分子检验床医师的医嘱),对手术标本和所有发现进行适当的描述。应描述标本解剖品放入组织处理器的酒精溶液(如70%乙醇)中。6.5脱钙脱钙是根据石蜡的柔软度调整骨骼的坚硬组分，宜用EDTA(乙二胺四乙酸)等脱钙液对其进行脱6.6处理及石蜡包埋固定后组织生物分子完整性受石蜡浸渗时间长短和温度高低的影响。宜选用标准成分和低熔点石蜡进行组织浸渗。组织包埋过程中每一步的温度和时长都应按照制造商提供的9GB/T42216.1—2022/ISO20166-1:2018贮存温度和时长会影响FFPE组织内RNA的稳定性[18(参见A.2.4),特别是组织档案室的环境用于RNA分离的FFPE组织宜新鲜制备。如果切片需要贮存，宜在干燥、冷藏(2℃~8℃)或低温(≤-20℃)环境中贮存尽可能短的时间。6.8RNA的分离色，应根据国际公认的组织病理学分类(如肿瘤的WHO/IARC分类[23)明确所用标本/样品是否具备该疾病细胞组成和疾病组织病理特征，并评估目标细胞所占比例。用于检测的组织中目标细胞的数量福尔马林固定致使组织中RNA加入单羟甲基团发生共价修饰[10],并且导致RNA和蛋白质交联。甲醛对组织RNA的化学修饰，会干扰后续检测过程的酶促反应，如逆转录-聚合酶链式反应(RT-a)最佳固定时长取决于组织类型和厚度。宜避免长时间固定，因其会导致RNA过度修饰。厚度5mm的组织宜在标准缓冲福尔马林溶液中固定12h～24h[20]。c)宜用平行切片进行苏木精/伊红(H&E)染色，对后续RNA纯化所用的未染色标本进行切割区域的鉴定、选择和控制。如果要用已染色的材料进行RNA纯化分离并且使用不含RNase的试剂，以尽量减少染色对RNA质量e)从FFPE组织分离RNA的所有过程宜包括逆转甲醛修饰(如核酸交联和蛋白质-RNA交联)的措施(如蛋白酶K消化和加热等),避免进一步的RNA降解。f)分离RNA过程宜保持在冰块或2℃~8℃(如冷却台)操作，并宜立即进行分析。g)为避免RNA检测过程中所生成的扩增物质产生交叉污染，除非使用封闭系统，RNA分离与GB/T42216.1—2022/ISO20166-1:2018宜在RNA能力验证计划中对RNA分离程序的性能进行评估。使用商品化试剂盒从FFPE组织中分离RNA时，应遵循制造使用不同厂家的产品可能会因为不兼容而影响结果。只有当各组分联合测试并确认其性能令人满b)将脱蜡后切片组织用裂解液重悬，用蛋白酶K进行消化，以除去交联的蛋白质，释放RNA。如果操作步骤中包括加热，裂解液不宜包含高浓度的阴离子。c)从裂解物中分离RNA可以采取单相或双相分离，如基于苯酚/三氯甲烷的方法，或固相吸附d)RNA分离程序宜包括DNase处理步骤或者其他减少分离RNA中DNA含量的措施。与样当从极少量的细胞(如激光显微切割单细胞)中分离RNA时6.9分离RNA的数量和质量评估a)通过吸光度测量(A₂s₀)或荧光光谱法进行定量；d)检测干扰物质的存在[使用外源性质控品(加入RNA和DNA质控品),或检查异常的qPCR为避免RNA在长期贮存过程中因水分蒸发而意外产生的冻干，因为RNA可对于长期贮存，宜建立一个经过确认的程序来组织并唯一标记含有分离的RNA或其衍生的等分宜遵循RNA提取试剂盒供应商的具体说明，在检测前保存分离的RNA。如果检测供应商的要求自己确认的RNA分离程序，那么所分离的RNA宜立即进行分析。如果不能立即检测所分离的RNA,实验室应具备经过验证的，在检测阶段之前使用合适存储溶剂(不含DNase的水)保存分离RNA的考虑到RNA提取程序和最终洗脱的RNA质量，在某种情况下，可以将提取的RNA置于冰上进对于长期贮存，分离的RNA宜用适宜的缓冲液洗脱，并且贮存温度应≤-70℃,见A.2.4,也可以GB/T42216.1—2022/ISO(资料性)基于RT-qPCR对从福尔马林固定和石蜡包埋(FFPE)组织样品分离的RNA进行质量控制”A.1概述以快速冰冻样品为对照，用从不同的人肝脏FFPE样品中提取的RNA来研究组织块的福尔马林固定、固定时间、贮存条件对下游反应[如互补DNA(cDNA)的合成、定量逆转录聚合酶链式反应(RT-qPCR)]及质量控制的影响。结果表明，使用福尔马林进行固定会导致cDNA合成以及RT-qPCR反应效率降低，并且会使主要基因转录本中引入变异。使用基于常规电泳和分光光度法的质量控制手段不能可靠地检测出这些差异，但是可以利用基于不同长度扩增片段的RT-qPCR和cDNA生成效率分析来检测2)。并且，在人类样品和动物模型中可以观察到由于存储条件和固定时间导致的RNA降解。A.2结果A.2.1RNA完整性的时间依赖性图A.1和图A.2显示使用福尔马林进行固定对RNA完整性的损害具有时间依赖性。Y——Ct值(阈值=0,2);4——24h;图A.1石蜡固定前用标准福尔马林固定不同时间的人肝脏样本中GPADH不同长度的片段的1)ResearchbytheEUFP/SPIDIAprojectf2)LibusJ.,StorchovaH.QuantificationofcDNAplealternativetoolforquantitativeRT-PCRnormalization.Biote在进行石蜡包埋前，将人肝脏组织的多个样品在标准缓冲福尔马林溶液中固定不同的时间，从A.2.2福尔马林固定对cDNA合成效率的影响相关，这种关联是预期的。但是在FFPE组织样品中，即使提供更多的模板RNA也只能产生少量的cDNA。图A.2中的误差条描述3次独立cDNA合成的中位数结果的标准差。YY22图A.2从快速冰冻和FFPE的人肝组织样本中分离的模板RNA逆转录生成的cDNA数量A.2.3固定和贮存在RT-qPCR中引入主要的基因间变异人肝组织标本的多个样品被快速冰冻，或使用标准缓冲福尔马林溶液固定并进行石蜡包埋。在不同时间点(6个月和1年)分离组织样品中的RNA。通过比较快速冰冻样品和FFPE样品的92个基因的RT-qPCR结果，发现Ct值平均差异从4个循环(6个月)至8个循环(1年),并且随着室温贮存时间的延长而增加(图A.3)。此外，与快速冰冻的参考样品相比，所有FFPE样品的RNA中都观察到主要转录本的变异。从FFPE样品中分离的RNA的这些差异以及基因特异性行为可能严重影响基因表达PTK2E露PTK2E露GB/T42216.1—2022/ISO20166-1:2018YY8器30X8图A.3快速冰冻和FFPE的人肝组织样本中92个基因的Ct值A.2.4贮存条件对FFPE组织块RNA完整性的影响为了检验FFPE大鼠组织样品RNA的RIN值，将FFPE大鼠组织块存储在不同温度(22℃、4℃、—20℃和一80℃),在贮藏开始(t₀)以及贮藏3、6、9、12、图中显示了每种贮存温度下从脾组织中分离的3份样品的RIN值(见图A.4)。在22℃贮存的组织块中观察到RIN值的持续下降，在4℃贮存的组织块中降解速度减缓。在冷冻组织块(-20℃和-80℃)的RNA中，RIN检验没有观察到明显的降解。3——贮存温度-20℃;图A.4从不同温度下保存的FFPE的大鼠脾脏组织样本中提取的RNA的RIN值GB/T42216.1—2022/ISO20166-1:2018A.3结论测时，与来自快速冰冻组织的未经化学修饰的RNA相比，这种影响可以导致扩增和cDNA合成效率检验前过程的标准化、额外的质量控制方式的应用和详细的样品信息可以显著提高基于FFPE组Kashofer,K.,etal.,QualitycontrolofRNApreservationandextissue:implicationsforRT-PCRandmicroarrayanalysis.PLoSOne,2013.8(7):p.e70714.Standardizationandimprovementofgenericpre-analyticaltoolsandproceduresfornosticshttp://www.spidia.eu/GB/T42216.1—2022/ISO[1]GB/T15000.2—2019标准样品工作导则第2部分：常用术语及定义[3]GB/T21415—2008体外诊断医疗器械生物样品中量的测量校准品和控制物质赋值的[6]SN/T2102.1—2008食源性病原体PCR检测技术规范第1部分：通用要求和定义[7]NingXH,XuCS,Sontochondrialbiogenesisduringsubsequen8]KapM,SieuwertsAM,KubistaM,etal.TheInfluenceofTit[J].BiopreservationandBiobanking,2015,13(3):200-2[9]KrafftA,DuncanB,BijwaardK,etal.OptimizationofRNAfromformalin-fixed,paraffin-embeddedtissue:Thearmedforcesinstituteofpathologyexperi-enceandliteraturereview[J].MolecularDia[10]MusadaM.Analysisofctimizationofmolecularbiologyapplicationsforsuchsamples[J].NucleicAcidsRes[11]KubistaM.,BjorkmanJ.,SvecD.RNAqualitymat[12]KarlK,ChristianV,MartinP,etal.QualityControlofRNAExtractionfromParaffin-EmbeddedTissue:ImplicationsforRT-PLoSONE,2013,8(7):e70714-[13]ViertlerC,GroelzD,Gündisch,Sibylle,etal.ANewTechnoomoleculesinTissuesforlarDiagnostics,2012,14(5):458-466.[14]GroelzD,SobinL,BrantonP,eAcomparisonofhistologyandRNAquality[J].ExperimentalandMole[15]NoviCD,MinnitiD,BarbaroS,etal.Vacuum-basedpresAnenvironmentally-safes2010,408(16):3092-3095.[16]FoxCH,JohnsonFB,WhitingJ,etchemistry&Cytochemistry,1985,33(8):845-gicalPathology:Issues.[J].ArchivesofPathology&LaboratoryMedicine,2008,132(12):1929.[18]SilkeVA,AndreasM,KlausB,etal.[19]ChungJY,BraunschweigT,WilliamsR,etal.FaGB/T42216.1—2022/ISOingThatImpactRNAObtainedFromFormalin-fixed,Paraffin-embeddedtochemistryandCytochemistry,2008,56(11):1033-1042.[20]SpechtK,RichterT,UlrikeMuller,etal.QuantitativecrodissectedArchivalFormalin-FixedandPathology,2001,158(2):419-429.[21]BurgemeisterR.NucleicAcidsExtractionfromLaserMicrodissecSections[J].MethodsinMolecularBiology,2011,724:1peraturestorageofRNA[J].EuropeanJournalofHumanGenetics,2014,22(3):37