一种制备唾液酸磁性表面分子印迹聚合物的新方法

摘要一锅法合成的氨基化磁性纳米颗粒Fe3O4@NH2，与对甲酰基苯硼酸（FPBA）反应嫁接上硼酸官能团，通过硼酸基与模板唾液酸Neu5Ac分子上的顺式二醇共价反应，将Neu5Ac定向固定于磁性纳米颗粒。以多巴胺（DA）及3-氨基苯硼酸（3-APBA）为功能单体，自聚合反应形成共聚壳层包覆在磁性纳米颗粒的表面，制备得Neu5Ac磁性分子印迹聚合物（MMIPs）。通过透射电镜、红外光谱对其形态及结构进行表征，并评价其吸附性能。结果表明，Neu5Ac磁性分子印迹聚合物对Neu5Ac具有较好的吸附量、较好的印迹效率、较好的特异性等优点；通过对Neu5Ac至少5轮吸附-洗脱的循环实验表明，MMIP具有较好的重复再利用能力。引言唾液酸是一类天然神经氨酸的N-或O-衍生物的总称。现已知的唾液酸成员有50多种，主要包括N-乙酰神经氨酸（Neu5Ac）、N-羟乙酰神经氨酸（Neu5Gc）和脱氨神经氨酸（KDN）3种核心结构。唾液酸基本上都是这3种核心成分的乙酰化、巯基化、甲基化、酯化和内酯化产物。唾液酸在机体生理、病理过程中发挥重要的作用。Neu5Ac、Neu5Gc是唾液酸最丰富的形式；人体内主要的唾液酸形式是Neu5Ac。研究表明，Neu5Gc可能参与了人体慢性炎症、肿瘤和心血管疾病如血管炎和动脉粥样硬化等的发展。来源于饮食的Neu5Ac可增加脑内唾液酸水平，促进神经发育、提高认知能力；Neu5Ac是保健品燕窝中的最重要成分。另外，KDN也可以作为Neu5Ac的替代品，在选择拮抗剂和保健食品添加剂方面发挥重要作用。据报道，已有多种方法来分析糖缀合物中的唾液酸，包括薄层色谱法、气相色谱法、高效液相色谱法和核磁共振波谱法等[7]。但是，这些方法的共同局限性是需要纯化样品以避免其他污染物的干扰。因此，对唾液酸的分离纯化对与唾液酸相关的食品药品质量、疾病代谢机理研究都有着重要的意义。利用分子印迹技术，模板分子与功能单体间共聚合成的对模板具有特异性识别能力的分子印迹聚合物，以其低成本、制备简单、物理和化学稳定性好，适应各种复杂样品环境和高特异性等优点在分离、纯化等领域有着广泛的应用。表面分子印迹法形成的表面印迹层更薄，印迹腔更靠近表面，模板分子更容易出入结合点位，提高了分子印迹聚合物对模板的结合能力和传质速率。苯硼酸（PBA）在碱性条件下可与唾液酸的顺式二羟基结构共价结合形成环状酯，当环境处于pH

7.4时，二者的结合常数大于PBA对其他糖类的结合常数；当环境pH变为酸性，环状酯解离。硼酸基化的磁性纳米颗粒（Fe3O4@BA），不仅可定向固定模板唾液酸分子，并可通过改变环境pH实现对唾液酸的快速吸附和解吸，这对后续制备均质的表面印迹聚合物极为有利。多巴胺（DA）是一种含有邻苯二酚和胺类官能团的生物分子，也可作为一种性能良好的分子印迹功能单体，在弱碱性水溶液中自聚合在物体表面，形成一层具亲水性和生物相容性的聚多巴胺膜，该膜的厚度可通过改变基体材料和多巴胺的质量比来调节。另据报道，3-氨基苯硼酸（3-APBA）也可作为功能单体自聚合。本文提出了一种基于模板的定向固定和表面分子印迹技术相结合，以DA及3-3-APBA为功能单体，制备唾液酸Neu5Ac磁性分子印迹聚合物（MMIP）的方法。该方法工艺简单、条件温和。目前尚无类似方法制备唾液酸Neu5Ac磁性分子印迹聚合物的文献报道。正文部分1

实验部分1.1

主要仪器与试剂1.2

表征1.3

Neu5Ac-MMIPs和MNIPs的合成下图为制备Neu5Ac磁性分子印迹聚合物（MMIP）的总体方案。1.4

吸附实验在吸附动力学实验中，称取2mgNeu5Ac-MMIPs（或MNIPs），加入2mL（10μg/mL）Neu5Ac溶液，室温孵育10～120min，磁力分离上清液和磁性聚合物。按照唾液酸荧光标记试剂盒说明书，使用1,2-二氨基-4,5-亚甲基二氧苯（DMB）荧光衍生物对上清液中未被吸附的Neu5Ac进行标记，HPLC检测，分析峰面积，对比标准曲线计算上清液中唾液酸的浓度，得到被吸附量。2

结果与讨论2.1

印迹条件的影响虽然DA和3-APBA都可单独的作为表面分子印迹的功能单体，但是DA对硼酸基的亲和力比Neu5Ac对硼酸基的亲和力强；若单独使用DA作为功能单体，DA可竞争取代定向固定于磁核表面的模板Neu5Ac；若单独使用3-APBA作为功能单体，产物印迹聚合物表面将残留数目可观的硼酸基团，即在印迹腔外也有大量非特异结合位点；以上两种情况都会严重影响印迹聚合物对Neu5Ac的特异性吸附效果。2.2

Neu5Ac-MMIPs的表征为验证磁性印迹聚合物制备过程中，各步骤的官能团修饰是否成功，我们对各步骤产物进行了傅里叶红外吸收光谱分析。如图2所示，Fe3O4@NH2、Fe3O4@BA、Neu5Ac-MMIPs

3种纳米材料在567cm-1附近都有一个较强的吸收峰，对应于Fe—O键的振动吸收峰。Fe3O4@NH2在1100cm-1附近的吸收峰对应于C—NH2的振动吸收峰，表明磁核表面确实已氨基化；尽管Fe3O4@BA上B—C键和B—O键的红外吸收峰很弱，在红外光谱中无法明显显示，但其在1100cm-1附近的振动吸收峰消失了，故依旧可推测此处的氨基与FPBA的硼酸基团发生反应；而在Neu5Ac-MMIPs上，C—NH2的振动吸收峰重新出现，这是由于聚多巴胺表面存在大量氨基基团，表明DA如期形成聚合层。Fe3O4@NH2和Neu5Ac-MMIPs在透射电镜下的形貌如图3所示，所制备的磁性纳米颗粒粒径约30nm，均一度好、分散性也不错。2.3

Neu5Ac-MMIPs的吸附动力学和等温吸附线2.4

选择性评价2.5

可重复性实验10%醋酸水溶液清洗后的Neu5Ac-MMIPs可以被回收重复使用。将分子印迹聚合物Neu5Ac-MMIPs对Neu5Ac连续进行5个吸附-洗脱循环实验，考察印迹聚合物的稳定性及吸附能力，结果如图7所示，结果表明，Neu5Ac-MMIPs性质很稳定，5次吸附-洗脱循环后其吸附量仍然可以达到第一次吸附量的93%。3

结论结论本文以硼酸基团修饰的磁性纳米颗粒为核，结合模板的定向固定和表面分子印迹技术，建立了一种制备核壳型唾液酸磁性分子印迹聚合物的方法。所制备的磁性分子印迹聚合物Neu5Ac-MMIPs对Neu5Ac最大理论吸附量为2.82mg/g，相应的印迹因子为2.18，说明具有较大的吸附量和较好的印迹效果；研究其吸附动力学曲线发现，Neu5Ac-MMIPs对于Neu5Ac在90min基本达到吸附平衡；在选择性吸附实验中，Neu5Ac-MMIPs表现出对Neu5Ac良好的选择性，对常见的6种单糖及Neu5Gc的选择性