应用指南 - 小规模纯化AAV-MAX系统生产的AAV

介绍Gibco™AAV-MAXHelper-Free无辅助病毒AAV生产系统是一生产。AAV-MAX系统包括一个克隆性HEK293F来源的悬浮细（booster）、转染增强剂（enhancer）和裂解缓冲液。策略1是一项较基础的工艺，不必使用昂贵的设备和过滤器，而是通过离心法直接澄清，并通过切向流过滤法（TFF）进行浓缩，这对于早期发现或实验室小规模的考察研究来说是POROS™AAVX亲和树脂分别实现了AAV血清型6（rAAV6）载体70%和49%的重组AAV总工艺回收率，证明了在典型的材料和方法根据AAV-MAX用户指南（出版号：MAN0019619），针对策略1和策略2分别在两个2.8L摇瓶和四个2.8L摇瓶中使用完整的AAV-MAX系统试剂盒（表1）生产rAAV裂解和核酸酶处理在收获时（转染后3天），将10倍Gibco™AAV-MAX裂解缓程中，加入最终浓度为2mM的MgCl2和最终浓的ThermoScientific™Pierce™通用核酸酶，以消化rAAV颗粒中未被衣壳化的DNA。将培养物放在37℃的培养箱中，在转速125rpm的摇床平台上培养2小时。策略1细胞裂解细胞裂解用AAV-MAX裂解缓冲液裂解2L细胞培养物澄清以6,000xg的速度离心30分钟；NalgeneRapid-Flow过滤装置（0.2μm）亲和性POROSGoPureAAVX预装柱，1mLMiniKros柱（10倍浓缩系数）策略2澄清澄清深层过滤器组：Millistak+C0SP过滤器，Millistak+F0HC过滤器，和Sartopore2XLG过滤器MiniKros柱（20倍浓缩系数）；6倍渗滤体积渗滤细胞裂解用AAV-MAX裂解缓冲液裂解4L细胞培养物亲和性POROSGoPureAAVX预装柱，1mL2表1.用于AAV生产和纯化的材料。工艺步骤工艺步骤材料描述货号AAV-MAXHelper-Free无辅助病毒AAV生产系统试剂盒A51217CN（含国产化细胞）AAV-MAX裂解缓冲液（10倍）A505201MMgCl2J61014.AK88702Pierce通用核酸酶88702ThomsonOptimumGrowth2.8L烧瓶（）50-112-006NalgeneRapid-Flow带PES膜的无菌一次性过滤装置（0.2μm）567-0020真空泵（Welch）I31-0176SorvallLYNX6000超速离心机75006590NalgenePPCO离心瓶3120-1000MasterflexL/S泵（）07522-20Masterflex铂金固化硅胶管，25号（）96440-2516100118Millistak+HCPro深层过滤器，C0SP（MilliporeSigma）MC0SP027H1Millistak+Pod深层过滤器，F0HC（MilliporeSigma）MF0HC027H1Sartopore2XLG过滤器（Sartorius）5441307G4-SS-BMasterflexL/S泵（）07522-20Masterflex铂金固化硅胶管，25号（）。96440-25PL1905847Q试剂瓶（Corning）431432MiniKros中空纤维TFF组件（Repligen）S02-E100-05-NSciLog压力传感器（Parker）080-699PSX-3P-5SciLog压力监测仪（Parker）SP0820J-1329POROSGoPureAAVX预装柱A36652策略1：离心澄清和TFF将用核酸酶处理过的细胞裂解液在20℃下以6,000xg的速度离心30分钟。将上清液倒入ThermoScientific™Nalgene™Rapid-Flow™无菌一次性过滤装置（0.2μm），并使用真空装置开始进行过滤。在2-8℃下储存一心澄清和过滤方案重新澄清已经过澄清的裂解液，然后装入以冲掉过滤器中的储存甘油，然后用过滤面积为1mL/cm2的以2,000s-1（368mL/min）的剪切率在HFTFF中再循环已经过澄清的裂解液。使用软管旋塞向再循环管路施加背压并进行倍后，将其收集起来。用1.4倍滞留体积的亲和平衡缓冲液来淋洗HFTFF，并将其与HFTFF产物混合。按照上使用NalgeneRapid-Flow一次性无菌过滤器装置（0.2μm）对混合的淋洗和HFTFF产物进行离心和过滤。3策略2：深层过滤澄清和TFF2/hrmL/min）的流速冲洗Millistak+™C0SP和F0HC深层过滤器，或者直至从过滤器中排出所有空气。将Millistak+C0SP过滤器的出口与F0HC过滤器的入口相连接；将F0HC过滤器的出口与Sartopore™2XLG过滤器的入口相连接。用1.5倍深层过滤器滞留体积（975mL）的澄清缓冲液以150L/m2/hr（67.5mL/min）的流速平衡整个过滤器组。以150L/m2/hr（67.5过滤器重新澄清已经过澄清的裂解液，然后将其加载到MiniKrosHFTFF柱上（表2）。用过滤面积为2mL/cm2的DI水新的中空纤维过滤器，以冲掉过滤器中的储存甘油，然后用过滤面积为1mL/cm2的亲和平衡缓冲液进行平衡。以2,000s-1（368mL/min）的剪切率在HFTFF中再循环已经过澄清的裂解液。使用软管旋塞向再循环管路施加背压并进行调整，使整液交换。缓冲液交换通过在保持20倍浓缩体积的情况下向样本槽中缓慢加入6个渗滤体积的亲和力平衡缓冲液2来进缓冲液交换完成后，收集材料。用1.4倍滞留体积的亲和平衡缓冲液来淋洗HFTFF，并将其与HFTFF产物混合。使用Sartopore2XLG过滤器过滤混合的淋洗和HFTFF产品。参数设置2,000s-1<5psi10倍或20倍6个渗滤体积25亲和纯化纯化前，用0.5NNaOH对ÄKTA™FPLC系统进行灭菌处理，CV的0.2M磷酸（接触时间为15分钟）、5个CV的6M盐酸胍、5个CV的2MHCL、5个CV的洗涤1缓冲液、10个CV的略2）以300cm/hr的流速对ThermoScientific™POROS™接下来，以300cm/hr的流速将过滤后的HFTFF产物加载到色谱柱上（相应的停留时间为1分钟）。待过滤后的HFTFF产物加载完成后，先后用10个CV的平衡缓冲液、三个不同的中间冲洗液（每种均为5个CV）、10个CV的平衡缓冲液洗涤色谱柱。用pH值为2.5的甘氨酸缓冲液洗脱rAAV6。先后用7个CV的0.2M磷酸（接触时间为15分钟）、5个CV的6M盐酸胍、5个CV的亲和平衡缓冲液、5个CV的2MHCL、10个CV的DI水对POROSGoPureAAVX柱进行剥离和灭菌处理，然后将其保存在5个CV的20%乙醇中。通过ddPCR对病毒基因组进行定量使用靶向GFP基因的引物和探针通过微滴式数字PCR（ddPCR）测定每毫升病毒基因组的AAV滴度（vg/mL）。在进行ddPCR然后，在QX200™微滴式数字PCR系统（Bio-Rad）上运行每测定完整衣壳的百分比根据制造商的说明使用AAV6ELISA试剂盒（Progen）壳滴度。用基因组滴度除以衣壳滴度，以测定洗脱组分中完整通过流式细胞仪对转导单位进行定量然后用连续稀释的rAAV6-GFP过程样本和5型腺病毒辅助病毒共同感染细胞。根据用流式细胞仪测定的每个孔的GFP阳性细胞数量来计算每个样本的转导单位（TU/mL）。浊度测量浊度测量全部在ThermoScientific™Orion™AQUAfastAQ30104表3.亲和纯化方法。缓冲液或溶液缓冲液或溶液0.980.980.2M磷酸50mMTris，1.5MNaCl，0.01%Pluronic™F-68表面活性剂，pH7.2PluronicF-68表面活性剂，pH7.2PluronicF-68表面活性剂，pH7.2B6B3B2B1A230030030030055555-0.98150.980.98150.98-0.98-0.98300-0.98-0.98300-0.98A13005-0.98A13005-0.98冲洗液30.98冲洗液3输出3输出53005A1-3005A10.98300.141分钟的停S1PluronicF-68表面活性剂，pH0.98300.141分钟的停S10.98PluronicF-68表面活性剂，pH7.20.9810300A1-10300A10.98PluronicF-68表面活性剂，pH7.20.98A23005-50mMTris，1.5MNaCl，0.01%PluronicF-68表面活性剂，pH7.2A23005-3000.983000.98A35-50mMTris，1.5M尿素，0.01%Pluronic3000.983000.98A35-A45-50mMTris，1%Tween™20表面活性剂，0.01%PluronicF-68表面活性剂，pH9.0A45-3000.98PluronicF-683000.9810A1-10A1PluronicF-68表面活性剂，pH7.21分钟的停0.98300.14A5B3B3B255250.98300300300-75mM甘氨酸，50mMNaCl，500mM精氨酸，0.01%PluronicF1分钟的停0.98300.14A5B3B3B255250.98300300300-0.98150.2M磷酸0.98150.98-0.98-0.98PluronicF-68表面活性剂，pH7.20.983005A1-3005A1PluronicF-68表面活性剂，pH7.20.980.98B1B6A6A73003000.980.98B1B6A6A73003003003005555-0.98-0.98--20%乙醇0.98-0.98--5结果就亲和层析前AAV6培养物的处理对两种不同策略进行了测试。策略1使用离心和过滤来产生澄清的裂解液，然后在生澄清的裂解液，然后在HFTFF上进行20倍浓缩和滤体积的缓冲液交换。每项策略的测试结果策略1：离心澄清经过裂解和核酸酶处理的AAV6培养物的浊度为302个散射浊度单位（NTU细胞培养物的滴度为7.85x1013vg/L（图2和3）。在0.2μmNalgeneRapid-Flow过滤装置上经过离心和过滤后，浊度降至16.49NTU，该过程的每步产率为94%，细胞培养的滴度为7.36x1013vg/L（图2和3）。在HFTFF上进行了53分钟的10倍浓缩，平均渗透通量为28L/m²/h在该步骤中未观察到滴度损失。将HFTFF产物在0NalgeneRapid-Flow过滤装置上进行离心和过滤后，浊度降载过程中，最大柱前压和△柱压均保持在0.0和纯化产物产生了5.49x1013vg/L的细胞培养物，每步产率为74%，整体过程产率为70%（图3）。Millistak+F0HC过滤器上的最大压力达到1.34psi。Sartopore2XLG过滤器上的最大压力达到0.8psi（图9）。澄清步骤将浊度降至1.03NTU，每步的产率为70%，细胞培养物的滴度为8.29x1013vg/L（图2和3）。在HFTFF上进行了52.6HFTFF上进行了总共22.9分钟的6个渗滤体积的缓冲液交换，平均渗透通量为21.4LMH。失降至最低，每步的产率为76%（图2和3）。HFTFF产物在Sartopore2XLG过滤器上进行过滤后，浊度降至7.47NTU。TFF产物策略2过滤后的TFF产物策略2过滤后的TFF产物感染性在整个纯化过程中保持不变；提取的细胞培养物和亲和产物的感染性值均为3.32x103vg/TU（图6）。该纯化不包括富集完整衣壳，所以完整衣壳的百分比在纯化过程的各个步骤中保持相对稳定，其范围约为20-30%（图7）。使用SDS，显示亲和产物的大小策略2：深层过滤器澄清经过裂解和核酸酶处理的AAV6培养物的浊度为442NTU，细胞培养物的滴度为1.18x1014vg/L（图2和3）。通过Millistak+C0SP、Millistak+F0HC和Sartopore2XLG过滤器组进行了74分澄清产物TFF产物过滤后的策略1的滴度策略2的滴度策略1的滴度策略2的滴度--策略2的每步产率图3.每个工艺步骤中细胞培养物的滴度和每步产率。通过ddPCR测定滴度（vg/mL然后用vg/mL以测定细胞培养物的滴度（vg/L）。通过该值，可以比较每个工艺步骤中两种纯化策略的滴度需考虑每步所处理材料的体积。滴度变化可用于确定每个工6策略1通量（LMH）策略1策略1通量（LMH）策略1TMP（psi）策略2初始渗滤策略2TMP（psi）器连接至过滤器的入口、截留物和透过物上。取入口和截留物压力的平均值，然后减去透过物压力，以计算出跨膜压（T塞来调整截留物的背压，使TMP达到目标值5psi。在TFF期间，每隔2-5分钟收集一次透过物并进行称重。用以kg为单位（与升相关）的透过物除以处理时间，以确定透过物的流速（升/时）。然后用透过这两种策略的渗透通量都是随着浓度系数的增加而衰减。在缓冲液交换期间，由于浓度在这一步保持不变，通量比较稳定。在整策略1UV吸光度280nm策略1UV吸光度260nm策略2UV吸光度280nm策略2UV吸光度260nm提取的细胞培养物亲和产物澄清产物TFF提取的细胞培养物亲和产物TFF产物策略2策略策略2图6.每个工艺步骤的感染性。感染性滴度（TU/mL）和vg/mL分别通过流式细胞仪和ddPCR测定。vg/TU的值通过vg/mL滴度除以感染性滴度计算亲和产物提取的细胞培养物澄清产物过滤后的TFF亲和产物产物策略1策略1图7.每个工艺步骤中完整衣壳的百分比。别通过ddPCR和ELISA测capsids/mL计算出完整衣壳的百分比。层析过程中，使用ÄKTAFPLC系统nm。初始宽峰（A）与流经亲和柱但未7无产物损失。在亲和加载过程中，UVA280信号仅达到215mAU，这表明一保持在0.07MPa以下。亲和纯化产物产生了5.78x1013vg/L的细胞培养物，提供了49%的总工艺取的细胞培养物（3.68x103vg/TU）和亲和产物（2.79x103vg/TU）保持富集完整衣壳，所以完整衣壳的百分比在纯化过程的各个步骤中保持相对用SDS，显示亲和产物的大小结论本文介绍了两种使用AAV-MAX系统两种策略都能获得高质量和高产量的为70%和49%。在策略2中观察到的策略1泳道描述1请参见BluePlus2标准品2亲和加载3亲和流穿液4亲和冲洗液15亲和冲洗液26亲和冲洗液37亲和产物8亲和剥离液9请参见BluePlus2标准策略2泳道描述1请参见BluePlus2标准2请参见BluePlus2标准3亲和加载4亲和流穿液5亲和冲洗液16亲和冲洗液27亲和冲洗液38亲和产物9亲和剥离液10请参见BluePlus2标准图8.亲和工艺步骤的样本SDS-PAPlus2预染蛋白标准品加载到Invitrogen™NuPAGE™4-12%Bis-Tris凝胶上，然后在200V下运行35分钟。接着使用Invitrogen™SimplyBlue™SafeStain对凝胶进行染色。处理时间（分钟）C0SP过滤器F0HC过滤器开始淋洗SartoporeC0SP过滤器F0HC过滤器开始淋洗Millistak+C0SP过滤器前面添加压力传感器1。在Millistak+C0SP和Millistak+F0HC过滤器之间添加压力传感器2。在Millistak+F0HC过滤器和Sartopore2XLG过滤器之间添加压力传感器3。在处理过程中，每隔5分钟记录一次压力读数。使用传感器1和传感器2之间的Δ压力测定Millistak+C0SP过滤器的压力。使用传感器2和传感器3之间的Δ压力测定Millistak+F0HC的压力。使用传感器3的压力读数测定Sartopore2XLG过滤器的压力。压力超过滤器堵塞。在运行期间，过滤器的压力均未超过2.5psi。8两种策略之间的显著区别是，策略2产生的中间产物浊度的A280值更低。策略2的澄清产物和TFF产物的分别低94%和90%。策略2在浓高33%，在亲和流穿液中的A280值比策略1低89此类差异，但两种策略的最终亲和产物在感染性、完整衣壳的百分比和产量方面是相当的。我们建议用策略1进行初始发现或小规模的考察研究。策略2适用于工艺开发工作，因为深层过滤步骤可以利用任何堆叠式或互锁过滤系统和过滤器支架进Holmes、KennethThompson和JonathanZmuda，Thermo附录：2L下游方案裂解1.收获时，在培养物中加入10倍裂解缓冲液，直至最终浓3.在培养物中加入核酸酶，直至最终浓度为90U/mL（Benzonase™核酸酶或Pierce通用核酸酶0.8mLPierce通用核酸酶）。4.搅拌裂解液，以确保各种成分充分混合。5.将裂解液倒入两个2.8L烧瓶中。6.在37℃下将裂解液以125rpm的速度振荡2小时。离心澄清1.将裂解液以6,000xg的转速离心30分钟。2.将含有AAV的上清液倒入0.2µm的Nalgene用深层过滤器进行澄清组装和平衡过滤系统：1.将管路连接到Millistak+C0SP过滤器的入口、通风口和出2.冲洗Millistak+C0SP过滤器。A.夹住出口管并打开排气管，开始用去离子（以600L/m2/hr（270mL/min）的流速冲洗C0SP过为确保将所有空气从过滤器中排出，夹住出口管和排气管，让过滤器的压力上升到<10psi，然后再打开排气管。继续执行该步骤，直至过滤器排气管没有气泡排出。用手或橡胶锤轻轻敲击过滤器也可以B.用DI水以600L/m2/hr（270mL/min）的流速冲洗C0SP过滤器，同时夹住排气管并打开保将所有空气从过滤器中排出，夹住出口管和排气管，让过滤器的压力上升到<10psi，然后再打开出口管。继续执行该步骤，直至过滤面积为100L/m23.冲洗Millistak+F0HC过滤器。A.将C0SP过滤器的出口管连接至F0HC过滤器的入口处，并在入口前安置一个压力传感器。将管路连接至F0HC过滤器的排气口和出口。B.夹住出口管并打开排气管，开始用DI水以600L/m2/hr（270mL/min）的流速冲洗C0SP和F0HC夹住F0HC出口管和排气管，让过滤器的压力上升到<10psi，然后再打开F0HC排气管。继续执行该步骤，直至F0HC排气管没有气泡排出。用手或橡胶锤轻轻敲击过滤器也可以帮助清除过滤器中的气9C.继续用DI水以600L/m2/hr（270mL/min）的流速冲洗C0SP和F0HC过滤器，同时夹住排气管并打开F0HC出口管。为确保将所有空气从F0HC过滤器中排出，夹住F0HC出口管和排气管，让过滤器的压力上升到<10psi，然后再打开F0HC出口管。A.将F0HC过滤器的出口管连接至Sartopore2XLG过滤器的入口，并在入口前安置一个压力传感器。将管路连接至Sartopore2XLG过滤器的出口。以150L/m2/hr（67.5mL/min）的流速流经所有三滞留体积（975mL）流经过滤器。澄清处理：1.以150L/m2/hr（67.5mL/min）的流速将所有用核酸酶处理过的细胞裂解液泵入过滤器组。压力不应超过102.用1.5倍过滤器组滞留体积（1,008mL）淋洗产物。如果澄清的裂解液之前已置于2-8℃的能会出现浑浊，需要使用离心方案或Sartopore2XLG过滤器A.夹住Pp管路，用至少0.25mL/cm2的DI水冲洗中注意：不要让色谱柱超过其能承受的最大压力，并3.测试中空纤维过滤器的完整性。A.倒出中空纤维中的所有DI水（注意此时的滞留体入空气，直至TMP达到5-7psi左右。C.注意TMP在1分钟内的下降量。下降值为2psi/minA.将Ps管路和Pr管路放入所需的平衡缓冲液中。C.