食用菌菌种选择及菌种标准化生产技术课件

河北师范大学王立安教授一、食用菌菌种有关概念菌种：由人工方法培育出来的纯双核菌丝体。母种：由食用菌的孢子或者子实体别离而得的最初菌种。原种：将母种扩大到新的培养基上而培育出来的菌丝体。栽培种：由原种再扩大接种一次培养而得，可直接应用于生产。菌种老化：是指菌龄过长导致的菌丝代谢能力减弱、出菇能力下降的现象。菌种退化：是指菌种受高温等逆境因素或病毒感染等致病因素出现的菌种出菇能力下降的现象。

固体菌种和液体菌种

当前菌种问题二、国家对菌种管理的相关规定从事菌种生产经营的单位和个人，应当取得?食用菌菌种生产经营许可证?。仅从事栽培种经营的单位和个人，可以不办理?食用菌菌种生产经营许可证?，但经营者要具备菌种的相关知识，具有相应的菌种贮藏设备和场所，并报县级人民政府农业行政主管部门备案。栽培种?食用菌菌种生产经营许可证?由所在地县级人民政府农业行政主管部门核发，报省级人民政府农业行政主管部门备案。母种和原种?食用菌菌种生产经营许可证?，由所在地县级人民政府农业行政主管部门审核，省级人民政府农业行政主管部门核发，报农业部备案。1.生产经营母种和原种的条件2.生产经营栽培种的条件3.对食用菌菌种生产的规定4.对食用菌菌种经营的相关规定菌种经营单位和个人应当建立菌种经营档案，载明菌种来源、贮存时间和条件、销售去向、运输、经办人等内容。经营档案应当保存至菌种销售后2年。销售的菌种应当附有标签和菌种质量合格证。标签应当标注菌种种类、品种、级别、接种日期、保藏条件、保质期、菌种生产经营许可证编号、执行标准及生产者名称、生产地点。标签标注的内容应当与销售菌种相符。菌种经营者应当向购置者提供菌种的品种种性说明、栽培要点及相关咨询效劳，并对菌种质量负责。5.判断假菌种、劣质菌种的标准具备以下条件之一的为假菌种：〔1〕以非菌种冒充菌种；〔2〕菌种种类、品种、级别与标签内容不符的。具备以下条件之一的为劣菌种：〔1〕质量低于国家规定的种用标准的；〔2〕质量低于标签标注指标的；〔3〕菌种过期、变质的。6.菌种种性与新品种认定三、优良菌种的标准与检测母种：菌丝粗壮、洁白，生长健壮有力，无任何杂菌；不发黄，不老化，培养基不失水；培养皿检测培养无扇变，菌落圆形，边缘整齐。菌龄掌握在刚长满斜面即用于扩接原种或继代培养。原种、栽培种：〔1〕菌丝洁白、无杂菌，棉塞、纸盖均无霉点，菌丝满瓶或袋。菌丝长满瓶或袋后，外表分泌茶色液滴，有少数原基形成，可视为正常。〔2〕翻开瓶或袋口塞有食用菌独特的芳香味，无霉味和酸臭味。〔3〕随机挖取一块菌种，成块而有韧性、不松散。将菌种块接到新的培养基上，在25℃下培养，菌种萌发正常。劣质原种、栽培种的表现是菌丝外表出现杂菌斑纹〔拮抗线〕，菌丝细弱，脱壁萎缩，发黄老化，这样的原种、栽培种不能用于生产。1.菌种质量鉴定菌种鉴定〔6方面〕：纯度、长势、菌龄、均匀度、出菇快慢。出菇试验是最可靠、最实际的方法。产量高、品质好→优良菌种。1.母种的引进引种要从有实力，信誉度高的科研单位引种。必须做到：一看试管和瓶上是否贴有标签；二看标签上的菌种名称、菌种代号、接种时间是否符合所要求的品种；三看试管或菌种瓶内菌丝长势，是否污染或老化；四看管口或瓶口棉花塞是否松脱，管、瓶有无破裂。2.母种质量鉴定控制转管次数，转管2～3次为宜，最多不超过4次。〔菌种培养的时间越长，菌龄越大，生活力下降，菌种易老化〕出菇试验：菌丝生长健壮，出菇快、朵形好、产量高，为优良菌种。外观肉眼鉴定：外表菌丝浓白、粗壮、富有弹性，那么生命力强；菌丝已枯燥、收缩或菌丝自溶产生大量红褐色液体，那么生活力降低。长势鉴定：菌丝生长快、整齐，浓而健壮，是优良品种。温度适应性鉴定：一般菌类在30℃，高温型菌在35℃，培养4h，在高温下，仍能健壮生长，为优良菌种；在高温下，菌丝萎缩，为不良菌种。干湿度鉴定：能在偏干或偏湿培养基上生长良好的菌种，为优良菌种。3.原种和栽培种的质量鉴定3.1菌种传代和菌龄应在规定范围内〔1〕用转管在4～5次以内的母种生产的原种和栽培种。〔2〕一般食用菌的原种和栽培种，在常温下可保存3个月内有效；草菇、灵芝、凤尾菇等高温型菌那么保存1个月内有效。超过上述期限的菌种，即使外观健壮，生产上也不使用。3.2原种及栽培种外观要求〔1〕菌丝生长健壮，绒状菌丝多，生长整齐。〔2〕菌丝已长满培养基，银耳的菌种还要求在培养基上分化出子实体原基。〔3〕菌丝色泽洁白或符合该菌类菌丝特有的色泽。〔4〕菌种瓶内无杂色出现和无杂菌污染，。〔5〕菌种瓶内无黄色汁液渗出，反之，说明菌种老化。〔6〕菌种培养基不能干缩与瓶壁分开。3.3常见优质原种和栽培种的性状〔1〕平菇：菌丝粗壮，浓白，密集，爬壁力强，菌柱断面菌丝浓白，清香，无异味，发菌快。〔2〕金针菇：菌丝洁白，较粗壮，密集，长绒毛，外观似细粉状，培养后期菌种外表易产生菇蕾。〔3〕香菇：菌丝洁白，绵毛状，后期见光易分泌出酱油色液体，呈褐色，有时外表产生小菇蕾。〔4〕双孢蘑菇：菌丝灰白带微蓝，密集，细绒状，气生菌丝少，贴生菌丝在培养基内呈细绒状分布，有特有的蘑菇香味。四、菌种标准化生产〔一〕标准化制种场地〔二〕母种评价筛选与复壮〔三〕菌种制备与培养〔四〕菌种保存〔一〕标准化制种场地可参照“Ｕ〞字型房，以方便生产。包括：配料室、灭菌室、冷却室、接种室、菌种培养室、销售室以及库房等。周围环境要卫生。灭菌室：要求水电平安方便，通风良好，空间充足，散热畅通。冷却室：洁净、防尘、易散热。接种室：要设缓冲间，防尘换气性能良好，内壁和屋顶光滑，经常清洗和消毒。做到空气洁净培养室和贮存室：内壁和屋顶光滑，便于清洗和消毒。培养室和贮存室墙壁要加厚，利于控温。菌种检验室：水电方便，利于装备相应的检验设备和仪器根本设备：磅秤、天平、高压灭菌锅或常压灭菌锅、净化工作台、接种箱、调温设备、除湿机、培养架、恒温箱、冰箱、显微镜等及常规用具，产量大的菌种厂还应配备搅拌机、装瓶装袋机。高压灭菌锅应使用经有关部门检验的平安合格产品。根本设施：配料、分装、灭菌、冷却、接种、培养等各环节的设施规模要配套。冷却室、按种室、培养室和贮存室都要有调温设施。〔二〕母种评价筛选与复壮1．菌种复壮的方法菌种来源：试管斜面种或采用组织别离的试管斜面种。评价筛选与复壮操作：〔1〕从斜面种中挑取远离接种点下面的菌丝少许，接种到与试管培养基成分不同的平板培养基中，每一平板可接3-4块。25℃恒温培养箱中培养5天后，观察菌落形态。〔2〕从形态圆形、规整，生长旺盛的菌落周边，在显微镜下应用显微操作器把菌丝尖端切下〔可用无菌小刀切取菌落边缘的菌丝尖端进行别离移植，也可用无菌毛细管截取菌丝尖端单细胞进行纯种别离〕，转接到与平板培养基成分不同的平板上。25℃条件下继续培养，采用相同操作，对菌种进一步挑选、脱毒、复壮。〔3〕直至菌落呈规那么圆形，菌丝生长明显加快。挑取菌落边缘菌丝，接种到与与平板培养基成分不同的试管斜面中。25℃恒温培养箱中培养7-10天后，密封试管口，于4℃冷藏箱保存。此为复壮菌种。图1.大棕菇提纯复壮图2.香菇A288提纯复壮图3.香菇灵仙一号提纯复壮图4.姬菇P20提纯复壮图5.蜜环菌提纯复壮香菇母种脱毒复壮前发菌情况香菇母种脱毒复壮后发菌情况2.筛选复壮菌种的检测方法直接观察：用肉眼观察复壮后试管中菌丝洁白、粗壮，爬壁能力强。显微镜检查：在载玻片上滴一滴蒸馏水，然后挑取少许菌丝置水滴上，让菌丝体充分展开，盖好盖玻片，再置显微镜下观察。也可通过菌丝体染色后镜检观察。复壮菌种菌丝体应粗壮，菌丝节较长，呈分枝状；与未复壮前菌丝节很短，分枝很浓密，菌丝较纤细形成比照。经特殊染色后，应能看到双核及锁状联合，以确保复壮后菌丝为双核菌丝。3.菌丝生长速率测定将复壮菌种，转接至PDA平板培养基中央，待菌丝形成放射状菌落后，用直径0.5cm的无菌打孔器研菌落边缘同心圆处取菌丝块，将相同大小的菌块接种到PDA平板培养基上〔每一平板可接3块，均匀摆放小，相当于3次重复。25℃恒温培养5天后，每隔24小时测定菌落直径，连测5天，计算并统计菌丝平均生长速度。复壮后菌丝平均生长速度应高于未复壮前。4.其他指标测定〔三〕菌种制备与培养1.标准化生产对菌种培养时间的要求母种最正确培养时间7-10天，菌龄掌握在刚长满斜面即用于扩接原种或继代培养。原种接种后应在40-50天长满瓶，菌龄掌握在菌丝长满瓶10天左右使用。栽培种接种后菌丝应在30-45天长满瓶，菌龄掌握在菌丝长满瓶后15天内使用。2.4容器要求：〔1〕母种：使用玻璃试管和棉塞，试管18mm×180mm或20mm×200mm，棉塞要使用梳棉，不应使用脱脂棉。〔2〕原种：使用650mL-750ml，耐126℃高温的无色或近无色的玻璃菌种瓶，或850ml耐126℃高温白色半透明符合GB9687卫生规定的塑料菌种瓶，或15cm×28cm耐126℃高温符合GB9688卫生规定的聚丙烯塑料袋。也可用能满足滤菌和透气要求的无棉塑料盖代替棉塞。〔3〕栽培种：同原种。也可使用≤17cm×35cm耐126℃高温符合GB9688卫生规定的聚丙烯塑料袋。2.5培养原料：〔1〕化学试剂类：这类原料如硫酸镁、磷酸二氢钾等，要使用化学纯级试剂。〔2〕生物制剂和天然材料类

生物制剂如酵母粉和蛋白胨，天然材料如木屑、棉籽壳、麦麸等，要求新鲜、无虫、无螨、无霉、洁净枯燥。〔3〕培养基配方

母种培养基：一般使用马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA：马铃薯200g(用浸出汁)，葡萄糖20g，琼脂20g，水1000mL，PH值自然)或综合马铃薯葡萄糖琼脂培养基〔CPDA：马铃薯200g(用浸出汁)，葡萄糖20g，磷酸二氢钾2g，硫酸镁0.5g，琼脂20g，水1000mL，pH值自然。特殊种类需参加其生长所需特殊物质，如酵母粉、蛋白胨、麦芽汁、麦芽糖等，但不应过富。严格掌握PH值。2.6常用原种和栽培种培养基：根据当地原料资源和所生产品种的要求，使用适宜的培养基配方，严格掌握含水量和PH值。2.6.1以木屑为主料的培养基配方：适用于香菇、黑木耳、毛木耳、平菇、金针菇、滑菇、鸡腿菇、真姬菇等多数木腐菌类。1.阔叶树木屑78%，麸皮20%，糖1％，石膏1％，含水量58%士2%。

2.阔叶树木屑63%，棉籽壳15％，麸皮20%，糖1％，石膏1％，含水量58%土2%。

3.阔叶树木屑63%，玉米芯粉15％，麸皮20％，糖1％，石膏1%，含水量58%土2%。2.6.2以棉籽壳为主料的培养基：

适用于黑木耳、毛木耳、金针菇、滑菇、真姬菇、杨树菇、鸡腿菇、侧耳属等多数木腐菌类。

1.棉籽壳99%，石膏1％，含水量60％土2%。

2.棉籽壳84％-89%，麦麸10%-15%，石膏1%，含水量60%士2%。

3.棉籽壳54-69%，玉米芯20％-30％，麦麸l0%-15%，石膏1％，含水量60%土2%。

4.棉籽壳54％-69%，阔叶树木屑20%-30%，麦麸10%-15%，石膏1%，含水量60％士2%。2.6.3以棉籽壳或稻草为主的培养基：

适用于草菇。

1.棉籽壳99%，石灰1%，含水量68%土2％。

2.棉籽壳84%-89%，麦麸10%-15%，石灰1%，含水量68%土2％。

3.棉籽壳44%，碎稻草40%，麦麸15%，石灰1%，含水量68%土2％。2.6.4腐熟料培养基：适用于双孢蘑菇、大肥菇、姬松茸等蘑菇属的种类。

1.腐熟麦秸或稻草〔干〕77%，腐熟牛粪粉〔干〕20%，石膏粉1%，碳酸钙2%，含水量62%土1%，PH7.5。

2.腐熟棉籽壳〔干〕97%，石膏粉1%，碳酸钙2%，含水量55%土1%，PH7.5。2.6.5谷粒培养基：小麦、谷子、玉米或高梁97%-98％，石膏2%-3％，含水量50%±1％，适用于双孢蘑菇、大肥菇、姬松茸等蘑菇属的种类，也可用于侧耳属各种和金针菇的原种。2.7分装要求：

母种培养基的分装量掌握在试管长度的四分之一至五分之一，灭菌后摆放成的斜面顶端距试管口不少于50mm，原种和栽培种培养基装至距瓶(袋)口不少于60mm，灭菌后不少于45mm。棉塞大小松紧要适度。原种和栽培种培养基的松紧度要一致。2.8灭菌要求：

母种的培养基配制分装后应立即灭菌；原种和栽培种培养基配制后应在4h内进锅灭菌。母种培养基灭菌0.11Mpa—0.12Mpa，30min，木屑培养基和草料培养基灭菌0.12MPa，1.5h或0.14MPa—0.15MPa，1h，谷粒培养基、粪草培养基和木塞培养基灭菌0.14MPa—0.15MPa，2.5h。装容量较大时，灭菌时间要适当延长。灭菌完毕后，应自然降压，不应强制降压。常压灭菌时，在2h之内使灭菌室温度到达100℃，保持100℃8h—10h。母种培养基、原种培养基、谷粒培养基、粪草培养基和木塞培养基，应高压灭菌，不应常压灭菌。灭菌时应防止棉塞被冷凝水打湿。2.9灭菌效果的检查：

母种培养基置于28℃恒温培养，原种和栽培种培养基经无菌操作接种于GB4789.28--1994中4.8规定的营养肉汤培养基中，于28℃恒温培养，48h后检查，无微生物长出的为灭菌合格。2.10冷却要求：

冷却室使用前要进行清洁和除尘处理。地面铺消毒过的塑料薄膜后，将灭菌后的原种瓶〔袋〕或栽培种瓶〔袋〕放置在冷却室中冷却到料温降至适宜温度。2.11接种过程规定：接种室〔箱〕的根本处理程序：

清洁→搬入接种物和被接种物→接种室〔箱〕的消毒处理。接种室〔箱〕的消毒方法：用药物消毒并用紫外灯照射。净化工作台的消毒处理方法：

先用75％酒精或新洁尔灭溶液进行外表擦拭消毒，然后预净20min。接种操作：

在无菌室〔箱〕或净化工作台上严格按无菌操作接种。接种完成后及时贴好标签。接种室〔箱〕后处理：

接种室每次使用后，要及时清理清洁，排除废气，去除废物，台面要用75％酒精或新洁尔灭溶液擦试消毒2.12培养室处理及后期管理：在使用培养室的前两天，采用药物消毒。培养条件：

根据培养物的不同生长要求，给予其适宜的培养温度〔多在22℃--28℃〕，保持空气相对湿度在75%以下，通风，避光。培养期的检查：

各级菌种培养期间应定期检查，及时拣出不合格菌种。入库：完成培养的菌种要及时登记入库。记录：生产各环节应详细记录。留样：各级菌种都应留样备查，留样的数量应以每个批号母种3-5支，原种和栽培种5-7瓶〔袋〕，于4℃-6℃下贮存，贮存至使用者在正常生产条件下该批菌种出第一潮菇〔耳〕。〔四〕菌种退化及组织别离法菌种退化的原因分析防止菌种退化的措施菌种组织别离法1.菌种退化的原因分析〔１〕菌种混杂在菌种继代培养过程中，不同品种间交叉感染，导致不同品种的菌丝体混杂在一起，菌丝生长发生变异，导致原有品种生产性状的改变，常常表现出产量下降、质量变劣等。〔２〕有害突变的发生一般来说，一个正常菌株经过多代移植，不会导致遗传性状的改变。但是如果一个菌株的菌丝细胞中发生有害突变，而且突变体能适应外界环境条件。那么，随着移接次数的增加，有害突变体在菌丝细胞群中所占的比例会逐渐增大。这样，该菌株的生产性能就会随之恶化，退化现象就逐渐显现出来。〔３〕杂交菌株的双亲核比例失调杂交菌株的菌丝体在转管过程中，受到外界环境、营养条件等改变的影响，其中一个亲本的核发育正常逐渐占据优势而另一亲本的核可能不适应而逐渐减弱，这样导致双核比例的失调，随着扩管代数的增加，核比例失调逐渐扩大，最终导致在栽培中表现出退化现象。〔４〕病毒的感染菌种感染病毒后，病毒不仅会随着菌丝体的扩大繁殖而增加，而且会通过带毒孢子传染下一代。当菌种携带一定浓度的病毒粒子，在栽培中都会表现出明显减产，菇质量下降等退化现象。2.防治菌种退化的措施〔１〕要防止菌种的混杂，在菌种转管，进行出菇试验等工作中，均应加强品种隔离，减少品种间的混杂，以保证优良品种的遗传组成在较长时间内能保持足够的稳定。〔２〕控制菌种传代次数菌种传代次数越多，产生变异的机率就越高，因此菌种发生退化的概率就会越多，生产中应严格控制菌种的移接代数。〔３〕采用有效的菌种保藏方法保存菌种菌种保存应是短期、中期和长期三者相结合，根据不同的要求从不同保藏方法中进行扩和移接，确保菌种能长期保持该品种的原有优良性状。〔４〕创造菌种生长良好营养条件和外界环境菌种培养基的营养条件应适宜，才能使菌种生长健壮，减少退化的发生。营养缺乏和过于丰富对菌种生长均不利。菌种的生长繁殖受到物理、化学、生物等外界条件的影响，如条件适宜，菌种生长正常，不易退化，不相适宜，那么会引起菌种的退化。比方芳香族化合物，能诱发绒毛状菌丝体成扇形菌落的形成，这种菌丝体在料床上易形成致密的白斑，导致产量下降。〔５〕对菌种可能遭受病毒的感染应保持足够的警惕。对有疑问的菌种要及时检验。确证已感染病毒，尤其是病毒粒子含量大，菌丝体及子实体性状已受到严重影响的菌种，应及时淘汰。3.菌种组织别离法概念组织别离：是指在双核菌丝的组织上切取一块组织，使其在培养基上萌发而获得纯双核菌丝体的方法。称作原始母种。种类：据切取的组织来源，分为子实体组织别离、菌核、菌索组织别离和基内菌丝组织别离。特点：一是简单易行。二是无性繁殖，得到的菌种可直接用于生产。4.子实体组织别离过程培养基制备。参照前面母种培养基。种菇选择：是指用来进行组织别离的子实体。要选择适宜出菇期出菇早、出菇整齐、形态正常、无病虫害、产量高的栽培袋，从上选择肥大、肉厚、6成熟的幼嫩子实体，切去多余菌柄。接种场地消毒。种菇处理：外表消毒。接种过程：双手外表消毒后把种菇进入接种箱，点燃酒精灯，种菇外表消毒后从中间纵向撕开，用无菌小镊子夹取菌柄、菌盖交界处的菌肉组织，迅速放入培养基上，塞上棉塞。特殊种类：灵芝、金针菇、鸡腿菇等。培养。适宜条件下，2-3天组织块上即萌发出菌丝，8-10天可长满。期间要检查。基内菌丝组织别离以及菌核和菌索的组织别离过程与此类似，只是所取部位不同。原始母种还可转接扩繁3-4次，以增加母种量。防止保藏母种老化衰退如下：〔1〕贫、富培养基轮用。保存菌种的培养基不能营养太丰富，否那么菌丝生长过旺易老化，且产生较多的有害代谢物而导致菌种死亡。因此大都采用PDA。食用菌在PDA培养基生长虽细弱，但不易老化、生命保持期长；而在加富〔如蛋白胨、酵母膏、麸皮浸液等〕的PDA培养基上菌丝生长虽旺盛，但易老化、生命保持期短。因此，斜面菌种轮用贫、富培养基保藏，有利于其优良种性的保持和复壮。〔2〕经常更换培养基。同一菌株假设长期使用某一培养基，菌丝的生长速度减慢，会出现菌丝细弱、断节、稀疏的现象。这是因为菌丝一直生长在半合成的同一基质上，与其自然生长环境不同，某些酶和活性物质