《B细胞单克隆抗体制备技术》问答

北京义翘神州·在线讲座一一《B细胞单克隆抗体制备技术》答疑环节汇总非常感谢大家对北京义翘神州在线讲座的大力支持，本次讲座已圆满结束，我们对直播过程中答疑环节大家的提问以及老师的解答进行整理如下。如果有需要补充的，有任何建议或想听到其他更多相关主题的讲座，欢迎来信和我们交流，我们会根据您的宝贵意见不断完善，以后给大家带来更多更精彩的在线讲座！marketing@问题1：请问B细胞体外是如何培养的？B细胞在体外能—直增殖吗？答：我们在讲座中也有提到，需要添加饲养层细胞、细胞因子、有丝分裂原和免疫原等进行培养，目前的培养方法不能使其—直增殖，两周后基本上就结束培养了。问题2：测序鉴定后找到合适的序列，后续的流程是什么？稳转用什么细胞系？答：后续先小试表达测活。稳转用的是CHO细胞。问题3:你们这B细胞方法制备抗体和纳米抗体比较有何有缺点？答：B细胞是制备抗体的—种方法，纳米抗体是抗体中的—种形式，可以通过B细胞平台来制备纳米抗体。问题4：怎么排除抗体有非特异性结合引起的副作用？答：如果是指用B细胞的方式制备抗体，那么前期培养上清的检测和后期抗体表达的检测可以最大限度挑选出特异性的抗体。问题5:上lOX单细胞测序分选有必要吗？答：lOX的分选仪器和试剂的成本肯定要高—些。主要取决于实验目的、实验通量以及经费等，常规的筛选可以不用，高通量的筛选或者治疗性的研究可以考虑。问题6:流式分选浆细胞用什么标志物？答：浆细胞作为抗体分泌型细胞，细胞膜表面没有抗体，不好作为分选的目标。—般是分选记忆B细胞。问题7:你们分选兔的B淋巴细胞是直接取脾分浆细胞然后再培养吗？答：—般是分选的记忆B细胞。问题8:目前只能做记忆B细胞的吗？答：只要有明确的表面抗原且有对应抗体，都可以分选。问题9:B细胞培养法和直接克隆轻重链的方法，是分选同—种细胞吗？培养法需要分选成熟B细胞还是记忆B细胞，直接裂解克隆需要记忆B细胞还是浆细胞？答：是分的同—种细胞，都是先分选记忆B细胞。问题10:人的B细胞分选用的CD27,CD38,CD138?答：要看分选哪种类型，哪个时期的B细胞。浆细胞可能同时具有以上三个表面标志物，其他时期的B细胞不—定有。问题11:记忆B细胞增值分化的机制是什么？您公司是培养单个记忆B，还是培养—群分选后的阳性B细胞后续再分选单个阳性细胞呢？答：这个问题有些宽泛，我们知道机体内记忆B细胞再次遇到原致敏抗原剌激后，通过与记忆Tfh细胞的相互作用而迅速激活，大量产生抗原特异性lgG抗体，并促使长寿浆细胞分化，形成增强性二次应答。在体外呢，只能加多种剌激信号，来尽可能的启动记忆B回到浆细胞周期。我们是分选单个记忆B细胞进行培养。问题12:老师，你好，兔pbmc采血，你们是在免疫后多久采血的呢，效价可以作为参考吗？答：—般的话是在末次免疫后进行采血，时间的话大概是在末次免疫后的四天左右采血测效价，效价肯定是要作为—个重要参考依据。问题13:兔子免疫以后效价达到了，啥时候可以采血分选呢，有什么参考依据吗？答：末次免疫后4天采血检测，效价合格以后采血分选，大概是免疫后4-7天。外周血的分选时间没有明确的文献参考，最初做分选的时候，选的是已经免疫中的兔子，为了不影响免疫后7天左右处死动物做多抗，所以分选采血时间和处死动物时间—致，后期—直沿用。问题14：老师您好，请问之前北大谢晓亮团队直接用单细胞免疫组库VDJ测序的技术进行新冠病毒中和抗体的开发方法，您是怎么看待的，会成为主流吗？这个方法可以同时对几千的单个B细胞的VDJ同时测序？答：这个方法实际上就是我们在课件中提到的微流控分选单细胞的方法，那么因为该方法通量大，用的样本量小，所以现在已经成为市场上—个开发单细胞方法的主流。测序是通过分选后的细胞进行NGS,可以测序上万个细胞。问题15：不是直接分选抗原阳性的细胞吗？答：是直接分选的抗原特异性B细胞。问题16:请教—个问题，假如我有个项目想通过贵平台开始实施，在流式分选阶段，最后抗原的筛选中，如果我们提供的抗原含有尿素，请问贵平台有办法解决吗？还是必需提供可溶性的抗原？答：分选的抗原必须是可溶性的抗原，由于不知道是什么抗原，所以不好说去除尿素后抗原是否可溶。问题17：分选时，抗原筛选是需要标记荧光素吗？如果抗原含有尿素能不能操作？答：抗原筛选需要标记抗原，尿素的存在影响抗原标记，必须换液除去尿素。问题18：请问下任老师，FACS分选的时候，是基千怎么样的策略，选择的这个圈门方式？分选得到的到底属千哪类细胞？lgM-&lgD-是为了排除哪些细胞？谢谢答：分选到的是抗原特异性记忆B细胞，记忆B细胞不表达lgD、lgM也表现阴性。问题19:分选出的单B细胞需要在体外增殖扩大数量吗？答：体外细胞增殖不仅可以提前介入检测培养上清，确定特异性抗体，也有助于提高下游扩增成功率。既降低成本，又能提高后续实验效率，增加针对性。问题20:细胞分选了许多候选抗体基因比如100个之多，如何进行有效的验证？答：现在—般的话都是采取高通量检测的方式，如果是对细胞进行培养，那么我们可以先对细胞培养的上清进行—些ELISA以及—些其他比如竞争、或者是其他交叉的抗原种属的检测，这样的话都是在孔板里操作。或者还有—些其他的筛选系统，比如课件中讲的微流控或者是光导平台，都可以进行高通量操作。问题21：有没有流式细胞仪筛选单个B细胞的具体步骤，如果个人去做，成本如何？答：前期先要细胞染色，去掉死细胞，然后分选。外面分选，成本要3000-5000元不等。问题22:老师跨膜的设计抗原时也是选泽胞外端吗？答：是的。问题23:单个B细胞筛选后，抗体是如何组装的，我们可以设计它的重链和轻链引物？答：引物设计是根据抗体germline设计的。问题24:老师，请问B细胞培养是否可以不用饲养细胞？另外目前贵公司所用的3T3饲养细胞需要辐照吗？答：B细胞的培养最好是需要饲养层细胞的，由饲养层细胞提供它必须所需要的营养，是需要进行辐照的，让饲养层细胞的得到—定的生长抑制。问题25:3T3细胞除了照射，还有其它可以灭活的方法可用吗？答：除了照射呢，还可以通过添加—些细胞抑制剂的方法来达到跟照射—样的目的。问题26：老师，我想问—下，FACS分选后的单个B细胞培养的成活率有多少？答：从我们目前实验的结果以及了解到市场上的情况来看，单个B细胞如果去做培养的话，那么检测的阳性率大概是在10％左右，就是培养后的B细胞跟抗原特异结合的话，这样的阳性率有10％左右的样子。问题27：为什么分选过的B细胞，经ELISA只有10％的阳性率？答：主要涉及到细胞培养存活的问题，不是每次成活率都那么均—,跟免疫效果及免疫原也有—些关系。问题28：对千BCRVDJ测序，老师有什么看法？与单个B细胞PCR再测序相比，哪个优势大—些？答：单细胞PCR测序取决于PCR的成功率，BCR通过NGS的深度测序可以得到更多序列信息。周期上两者相差不大，单细胞PCR的成本更低，通量上肯定NGS更高，最终使用哪种方法还是要看实验目的。问题29:B细胞培养之后也需要用巢式per进行扩增吗？答：B细胞培养之后的细胞，有时候可以得到上百甚至上千个，它—般就是比单细胞的模板增加了很多。但是跟常规的我们做PCR的模板量相比还是要差很多，所以如果说PCR的话，有的细胞我们可以考虑用巢氏的方法去做。问题30:单个细胞直接裂解后与培养后PCR成功率咋样？答：我们说如果要是从PCR成功率看的话，那肯定是培养的PCR成功率更高，因为它的模板量会更高；但是如果你的PCR方法是经过—定优化的话，单个细胞直接裂解后的PCR而其实也是可以得到不少抗体序列的。问题31:老师您好，单细胞分选后，不做额外的培养，直接在单细胞层面做重链及轻链可变区的克隆，同时获得两个可变区基因的效率如何？答：如果说不做培养直接扩的话，那么他的扩增效率肯定不如做培养的扩增效率的高，所以我们建议如果是可以做培养的话，还是以培养的方式最好。但是如果说直接扩增的话，也是可以拿到不少抗体的基因序列的。问题32:单个B细胞培养后，是否还要再分选才能进行PCR?答：不需要再分选，直接PCR。问题33:请问在筛选的时候是先用CD138,再用特异性抗原筛选吗？分泌型和模型有区别吗答：用什么样的表面抗原需要根据你筛选的细胞来定，—般情况下，比如说鼠的话是用cdl9,然后再用这个特异性的抗原进行分选。分泌型和膜型的话，—般是现在是主要是用记忆B细胞，所以那就是膜表面的，没有做分泌的，因为分泌表面分泌的细胞没有抗体。问题34：如果是全人源抗体基因转染的小鼠，还有CD19分选吗？谢谢答：要用CD19分选。问题35：如果想委托你们帮忙筛选—个病人血液中的抗体，需要给你们提供多少血样？还是给你们提供外周血细胞？答：可以直接提供新鲜血样，具体用量依据筛选抗原的难易会有差距。问题36:cellassay的话，抗体在哪种细胞里面表达纯化？答：如果是做小试表达的话，我们建议可以在293里边做，如果要是上稳定株的话那就是CHO细胞。问题37:可以表达出new emigrant B cell(CD19+CD10+CD27—lgM+), mature naive B cell(CD19+CD10-CD27—lgM+)这两类未成熟B细胞的重组抗体吗？答：可以分选表达lgM未成熟B细胞。问题38:您的B细胞的富集是全部B细胞吗？后边的培养是浆细胞培养吗？最长能培养多久？细胞数量能增殖到多少？谢谢答：我们前面分选到的不是全B细胞，是抗原特异性的B细胞。培养的话也是从B细胞开始培养，因为浆细胞属于末端细胞，所以养起来困难更大。培养时间—般是要10天左右，可以培养成为浆细胞让它去分泌抗体，那么细胞数量的话，能增值到上百到上千的。问题39:B培养后，是需要再激活成浆细胞，然后才能检测上清吧？答：是的，诱导记忆B细胞分化为浆细胞，再检测。问题40：如何通过标记分选到抗原特异性B细胞？需要使用抗原作为标记物吗？答：需要标记要筛选的抗原，用来特异性识别产生特定抗体的B细胞。问题41:lgGl是分泌型抗体吗？如果是分泌型抗体怎么分选lgGl+的B细胞？答：记忆B细胞的抗体是在膜表面的，先分选记忆B细胞经过体外培养得到分泌抗体的浆细胞。问题42: lgG不是分泌型抗体吗？如何进行标记？答：因为我们分选的是记忆B细胞，记忆B细胞是在膜表面的，不是浆细胞。所以不存在说是因为它分泌了无法标记的问题。问题43:任老师，lgG以及抗原的双荧光标记，纯化后的蛋白可以用N或C端成酰胺键连接FITC吗？答：纯化后的蛋白—般是在N端或者非末端位置连接荧光素。北京义翘神州科技股份有限公司(SinoBiologicalInc.)重点从事重组蛋白、抗体、基因、ELISA试剂盒、培养基等产品，以及重组蛋白、抗体的开发和生物分析检测等服务。公司目前生产和销售的