QX200微滴式数字PCR系统

QX200™微滴式数字PCR系统V4.0PCR技术的发展历程普通PCR定性定量PCR相对定量数字PCR绝对定量数字PCR时代来临2011/10数字PCR时代来临2012/06数字PCR时代来临2012/07数字PCR时代来临2013/09微滴式数字PCR用于核酸标准物质定量微滴式数字PCR用于核酸标准物质定量数字PCR发展历程V4.0数字PCR背景BertVogelstein著名肿瘤学家微阵列芯片式数字PCR均一性差成本高通量低BIO-RAD微滴式数字PCR系统微滴分析仪微滴发生器2011年7月2012年3月2012年6月2012年12月QX100上市2012年度读者选择实验设备奖2012年度R&D100创新奖——美国科技界的奥斯卡2012年度北美数字PCR技术市场领导奖QX100/200™获得奖项QX100/200™用户分布全球各地微滴式数字PCR技术原理V4.0配制反应液将引物、探针、DNA模板、ddPCR

supermix配制成20ul反应液，加入到微滴发生卡上1引物和探针ddPCR反应液DNA模板DG8微滴发生卡检测微滴将96孔板放入微滴分析仪，顺序吸取每个样品的微滴并随载液流逐一通过双色检测器4

分析数据有荧光信号的微滴为阳性，无荧光信号的微滴为阴性，软件记录每个样品里阳性微滴的比例5微滴分析器

显示结果软件自动分析数据，并以多种方式显示检测结果6PCR扩增将微滴转移到96孔PCR板上，于PCR仪上进行扩增3PCR热循环仪制备微滴将微滴反生卡放入微滴生成器，在2.5分钟内将每个20ul反应液分成20000个微滴2微滴生成器微滴式数字PCR的基本流程生成均一化的微滴将含有样品的预混液和油加入微滴发生卡的指定位置，并放入微滴发生器内。每个样品可生成20,000个微滴，8个样品大约需2.5分钟将PCR反应板直接放入微滴分析仪，自动对样品进行逐个分析每个微滴逐个通过检测器，每小时可完成32个样品的检测快速微滴检测数字化结果——无需标准曲线实现绝对定量EverypartitionisanindividualreactionvesselEnd-pointPCRIfapartitionhasatargetmoleculeitwillbereadasapositiveIfapartitionhasnotargetmoleculesitwillbereadas

anegativeInquantitativePCR(qPCR)—timecourse,quantificationcycle(Cq)orthresholdcycle(CT),

standardcurves微滴式数字PCR提高检测灵敏度为什么提高了灵敏度BulkSample–20μL40,000wildtypemolecules40mutantmolecules19,960dropletsw/omutant40dropletsw/mutantPartitionedSample–20,000×1nLMutantabundance0.1%Mutantabundance33%精准的定量结果和极佳的重复性精准的定量结果和极佳的重复性zoominEachdatapoint=metawell1S.aureusdilutions(copies/ul)ConstanthumangDNA(RPP30)88,0002倍梯度稀释精准的定量结果和极佳的重复性S.aureusdilutions(copies/ul)ConstanthumangDNA(RPP30)zoomedin1.1倍梯度稀释QX200™微滴式数字PCR特点绝对定量，不依赖Ct值，无需标准曲线

兼容染料法和探针法，同时满足科学研究和临床检测要求适用复杂样品检测，不易受PCR扩增效率影响超高灵敏度，可检测单拷贝模板精准的定量结果和极佳的重复性微滴式数字PCR应用介绍V4.0——稀有事件检测（RED）方法：

采用ddPCR双重检测，引物/探针序列与qPCR相同 hmg基因作为野生型玉米内参基因

MON810引物探针用于特异性检测MON810转基因事件结论：

ddPCR的线性范围足够覆盖日常的GMO检测范围，无需对样品进行酶切aLOQ与aLOD方面，ddPCR的结果优于qPCR

与qPCR相比，ddPCR结果的真实度更高微滴式数字PCR用于转基因检测ddPCR双重实验检测转基因物质的线性范围涵盖了实验室常规GMO检测的所有浓度范围

(0.1%to100%transgene/endogeneratiocp/cp).ddPCR双重检测MON810/hmg的线性范围与qPCR用两个单重实验检测的结果相近，与cdPCR（2－3个数量级）相比线性范围更广。.TheddPCRresponseforhmgwaslinearfrom5to118,000hmgcopies(R2=0.9990).TheddPCRresponseforMON810waslinearfrom6to4,340MON810copies(R2=0.9993)微滴式数字PCR用于转基因检测Intra-andinter-cartridgerepeatabilityoftheddPCRwasassessedbytwodifferentoperatorsandovertwodifferentdaysforMON810contentdetermination.Sevenreplicateswereappliedpercartridge.Lessthan10%variabilitywasobservedwithineachofthefivecartridgesforthedeterminationofMON810content.微滴式数字PCR用于转基因检测微滴式数字PCR用于外周血中基因突变检测微滴式数字PCR用于外周血中基因突变检测微滴式数字PCR应用介绍V4.0——拷贝数变异检测（CNV）准确检测MRGPRX1基因拷贝数ddPCRIndividual

WellsddPCRMergedWells(6wells)MeasureMRGPRX1genecopiesfromvarioussamples56Copynumber123456IncreasedprecisionwithmergedwellsSampleSampleSignificance:Neurologicaldiseaseandfemalefertilityhavebeenlinkedtoastructurallycomplexregionofchromosome17(17q21.31).Problem:17q21.31hasinversionsandCNVsthataredifficulttoevaluateacrosspopulationsbecauseoftechnologicallimitations.NGSisusefulbutveryexpensive.Solution:ddPCRenableseasyvalidationandstudyofCNVsdiscoveredbysequencingfromastructurallycomplexlocusacrosspatientcohorts.NatureGenetics2012ddPCRconfirmsNGSandscreenswithsensitivityforCNV.微滴式数字PCR用于NGS结果确认Copynumberanalysisof3regionsof17q21.31bywhole-genomesequencing(b–d)and

byddPCR(e–g)Copynumberdeterminationin234samplesbyNGSandddPCRis>99%concordant(h–j)ddPCRprovidesaneasy,inexpensive,andaccuratewaytovalidateandfurtherstudyCNVsdiscoveredbyNGSBoettgerLMetal.(2012).Structuralhaplotypesandrecentevolutionofthehuman17q21.31region.NatGenet

44,881–885.微滴式数字PCR与NGS结果高度吻合微滴式数字PCR用于22q11.2微缺失征检测微滴式数字PCR用于22q11.2微缺失征检测微滴式数字PCR应用介绍V4.0——病原微生物检测微滴式数字PCR用于全球首例“功能性治愈”艾滋病婴儿TheProblem

AninfantwasbornHIVpositivebut2yearslaterhasnodetectablevirusbytraditionalmethodsNeedextremelysensitivequantificationofHIVgenomesinpatientsTheSolutionDevelopanultra-sensitiveHIVgenomedetectionprotocolusingddPCRAllowforconfirmationofastateoffunctionalHIVcureFunctionalHIVCureafterVeryEarlyARTofanInfectedInfantDeborahPersaud*1,HGay2,CZiemniak1,YHChen1,MPiatak3,T-WChun4,MStrain5,DRichman5,andKLuzuriaga61JohnsHopkinsUnivSchofMed,Baltimore,MD,US;2UnivofMississippiMedCtr,Jackson,US;3FrederickNatlLabforCancerRes,MD,US;4NIAID,NIH,Bethesda,MD,US;5UnivofCaliforniaSanDiego,LaJollaandVASanDiegoHlthcareSystem,US;and6UnivofMassachusettsMedSch,Worcester,US微滴式数字PCR用于全球首例“功能性治愈”艾滋病婴儿ApproachInfantinfectionconfirmedbypositiveHIVDNA/RNAtestingon2nddayoflifePlasmaviralloadtestspositiveondaysoflife7,12,20Reachedundetectablelevelsatage29daysUltrasensitiveHIVDNA(dropletdigitalPCR),plasmaviralload(singlecopy)assays,andquantitativeco-cultureassaysweredoneatage24and26monthstoassessHIVpersistenceAgeHIVDNAdetectedbyddPCRReplication-competentvi