HPLC-UV测定加替沙星的血药浓度

HPLC-UV测定加替沙星的血药浓度背景1.高效液相色谱：高效液相色谱是色谱法的一个重要分支，以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。高效液相色谱仪结构：①高压输液泵：驱动流动相和样品通过色谱分离柱和检测系统；②色谱柱：分离样品中的各个物质；③进样器：将待分析样品引入色谱系统；④检测器：将被分析组在柱流出液中浓度的变化转化为光学或电学信号；⑤馏分收集器：为做其它波谱鉴定或获取少量试验样品的小型制备，进行馏分收集；⑥数据获取与处理系统：把检测器检测到的信号显示出来。2.加替沙星是又一新型氟哇诺酮的C位用3一甲基呱嗓基取代的衍生物。具有抗菌谱广,抗菌活性强的特点。加替沙星对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌、厌氧菌、需氧菌及非典型致病原均有较强的活性，同时又具有口服吸收好,体内分布广,光毒性小等特点。二、目的掌握如何利用高效液相的方法测定家兔血清中加替沙星血浆药物浓度。研究注射液加替沙星在家兔体内的药代动力学特征。三、材料仪器：高效液相色谱仪、离心机、涡旋振荡仪；试剂：乌拉坦、加替沙星注射液、空白血浆、标准液、10%高氯酸溶液，所用溶液均为分析纯。四、方法动物实验：取健康家兔，称重，耳缘静脉注射乌拉坦（5ml/kg）麻醉，固定。耳缘静脉注射加替沙星注射液（30ml/kg），给药停止后分别于2,5,10,15,30,45,60,90,120min时进行血液样本采集，每次取血0.5ml，所用方法为股动脉取血，所取血液样本装入无菌微量离心管。色谱条件：色谱柱：ZORBAXExtend-C184.6×150mm；流动相：甲醇：0.05mol/L柠檬酸=25:75（pH=3）；流速：1mL/min；检测波长：293nm；柱温：40℃；进样量：20μL。绘制标准曲线：无菌微量离心管中加入空白血浆90μL、标准液10μL、10%高氯酸溶液100μL，涡旋振荡3min，然后12000rpm离心10min，取上清液120μL。取20μL上清液进样，进行HPLC分析，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标作标准曲线。样品测定：取100μL样品，加入100μL高氯酸溶液，剩余步骤同标准曲线，以取血时间为横坐标，峰面积为纵坐标作样本学药浓度曲线。五、实验结果标准曲线血药浓度曲线时间（min）25101530456090120面积515464385129268089200687129184105598822586291446352浓度（μg/ml)38.4828.6619.84714.7699.3837.6064.9094.39093.143浓度对数1.5852350631.4572761861.297694871.169351090.9723417160.8811563210.6909930320.6425535460.497344381药动学参数计算：由浓度时间曲线推断为房二室模型由浓度对数时间曲线得：分布速率常数α=0.0818lgA=1.6481药物的分布半衰期t1/2α=7.81min消除速率常数β=0.0074lgB=0.9008药物的消除半衰期t1/2β=86.35min=1.43h初始血药浓度C0=38.48(μg/mＬ)血药浓度－时间曲线下总面积AUC=41格*20μg/mＬ·min=13.67(μg/mＬ·h)Vd=(30mg/kg)*(2kg)/38.48(μg/mＬ)=1.559LCL=0.692(Ｌ/h)MRT=1/0.0074=135.13min六、讨论.采血：每只兔耳耳缘静脉有两条，采血前均应备齐，以免采血时不慎将血管破坏后不能及时采血；采集血样时应从耳尖向耳根方向依次取血，如任意采血，后几个点因血管被破坏无法采到；每次采血时应先使其剧烈运动，加速血液循环，便于采血；采血还应注意取血手法，应用中指垫住耳背，食指与无名指确定采血曲间，快而稳的进针，抽血时要慢，因耳缘静脉血管较细，如抽血过快血管易抽瘪，无法采血。样品处理：甲醇与乙腈是反相液相色谱法中常用的蛋白沉淀剂，因为它们与流动相的组成相同。甲醇沉淀蛋白的优点是上清液清澈，沉淀为絮状易于分离；乙腈与之相反，产生细的蛋白沉淀，但沉淀效率较甲醇高。因本实验流动相选择甲醇且取上清液，故选用甲醇沉淀蛋白。通过查找文献，加替沙星静脉滴注1h左右达血药浓度峰值，在推荐剂量范围内加替沙星血药浓度峰值和曲线下面积随剂量成比例增加。本药口服与静脉注射生物等效，口服绝对生物利用度约为96%，且静脉注射后1h的药动学与口服等剂量片剂相同，即静脉注射和口服两种给药方式可交替使用。加替沙星与蛋白结合率约为20%，与浓度无关。药物广泛分布于组织和体液中。本药无酶诱导作用，不改变自身和其他合用药物的清除代谢，且在体内代谢极低，主要以原形经肾脏排出。pH值的影响：pH值对保留时间和分离效果影响较大。考察在3.0，3.5，4.0，5.0分离效果，随着pH值的增大，保留时间延长，且不能完全分离环丙沙星和洛美沙星，而当pH值在3.5，3.0时分离较好，但pH=3.0时对色谱柱寿命有影响，所以选用pH=3.5。柱温的影响：考察了常温，20℃，30℃，40℃，45℃5种温度，温度越高，出峰越快，且柱效高，但高于40℃后变化不大，且对色谱柱寿命有影响，故本实验柱温定为40℃。关于实验结果：①加替沙星是第4代氟喹诺酮类抗生素,广泛应用于革兰阳性菌、革兰阴性菌、厌氧菌、衣原体、支原体等病原体引起的感染。本实验建立用高效液相色谱（HPLC）法测定加替沙星血药浓度方法,为临床合理用药提供参考；②由血药浓度时间曲线判断为房二室模型；③根据实验结果，分布半衰期为7.81min，表明静注加替沙星后7-8min就可分布在家兔体内各组织中，且分布量高，具有很高的抗菌浓度；④消除半衰期为1.43h，表明静注加替沙星后较长一段时间内，各组织仍有较高的抗菌浓度；⑤根据实验结果，半衰期数据比较符合文献的资料，说明药物代谢比较接近正常的情况；⑥根据表观分布容积，可看出药物基本分布在血液。关于实验操作：①在进行实验进样之前，需用甲醇冲洗色谱柱；