DB22∕T 3353-2022 猪δ冠状病毒检测 重组酶聚合酶扩增(RPA)法

DB22DB22/T3353—2022猪δ冠状病毒检测重组酶聚合酶扩增Recombinasepolymeraseamplificationmethodforthedetectionofporcinedeltacoronavirus2022-01-28发布2022-02-28实施吉林省市场监督管理厅发布I1反转录重组酶聚合酶扩增reversetranscription-recombinasepolymerascDNA互补脱氧核糖核酸（ComplementaryPBS磷酸盐缓冲液（PhosphaRPA开始反应后，引物与重组酶组合形成复合物，在模板中寻找同源双链DNA进行定位，完成定位后发生链交换反应，形成D-环状结构，使DNA结合蛋白与单链DNA链绑定。随后DNA聚合酶识别复2合物中重组酶解离引物后暴露的3′端，进行片段扩增，形成两条新的双链DNA，如此循环，从而完成ATGTGCCTGGTGTTCAGGAGATGCTTTTCGCTAGTTGGTTTGGTGGGTGGCTCATAGGTCTGG6.1.2磷酸盐缓冲液（PBS0.01mol/L，pH7.47.2台式低温高速离心机（4℃,12000r/min）。39.1.1采集肠管组织样品不少于5g（7.1）。做好9.2.1使用无菌棉签（6.2.1,7.5采集肛门粪便不少于5g，样品采集后冷冻或4℃4的扩增产物及Marker（6.1.9）分别加入凝胶孔（7.35V/min5Atggctgcaccagtagtccctactactgacgcgtcttggtttcaggtgctcaaagctcaaaataaaaaggctactcatcctcagtttcgtggcaatggaggcttaactccgccatcaaacccgttgaaaaccatggctactggctgcgttacaccagacaaaagccaggtggtactccgattcctccatcctatgccttttattatactggcacaggtcccagaggaaatcttaagtatggtgaactccctcctaatgacaccccagcaaccactcgtgttacttgggttaagggttcgggagctgacactattaagcctcatgttgccaaacgcaaccccaacaatcctaaacatcagctgctacctctccgattcccaaccggagatggcccagctcaaggtttcagagttgaccccttcaacgctagaggaagacctcaggagcgtggaagtggcccaagatctcaatctgttaactccagaggcacaggcaatcagcccaggaaacgcgctgcacccgctgcggtacgtcgtaagacccaacatcaagctcccaagcggactttacccaagggtaaaaccatttctcaggtatttggcaaccggtctcgcactggtgccaatgtcggctctgcagacactgagaagacgggtatggctgatcctcgcatcatggctctagccagacatgtgcctggtgttcaggagatgcttttcgcccaccttgagagcaactttcaggcgggggcaattacccttaccttctcttactcaatcacagtcaaggagggttctcctgactatgagagacttaaggatgcgctcaatacggtcgttaaccagacctatgagccacccaccaaaccaactaaggacaagaagcctgacaaacaagaccagtctgctaaacccaaacagcagaagaaacctaaaaaggtaactctgccagcagacaaacaggattgggagtgggatgatgcttttgagataaagcaggaatcagcagcg将感受态细胞E.coliDH5α置于冰上，待其融化；在超净工作台中将加入合成质粒1μL~3μL加入100μL感受态细胞，混匀，冰浴30min；42℃热激1min~2min，冰浴1min~2min；加900μL完全吸收后，37℃倒置培养12h~16h。PCR反应程序：95℃,5min；95℃,30s；58℃,30s，72℃,1min，72℃,10min，35个12h~16h。琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，统计含目标条带菌落号备用。6℃,180rpm,12h~16h；取3mL~5m