化学品 固有生物降解性 改进的MITI试验（II） 征求意见稿

1GB/TXXXXX—XXXX化学品固有生物降解性改进的MITI试验(Ⅱ)本文件规定了化学品固有生物降解性改进的MITI试验（II）的受试物信息、试验原理、参比物、试验系统、试验程序、质量保证与质量控制、数据与报告的要求。本文件适用于在试验浓度下非挥发性、对微生物无抑制作用、不与CO2吸收剂反应的化学品。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T21796化学品活性污泥呼吸抑制试验GB/T21845化学品水溶解度试验GB/T21851化学品批平衡法吸附/解吸附试验GB/T21855化学品与pH有关的水解作用GB/T22228工业化学品固体及液体的蒸气压在10-1Pa至105Pa范围内的测定静态法GB/T22229工业化学品固体及液体的蒸气压在10-3Pa至1Pa范围内的测定蒸汽压平衡法3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1固有生物降解性inherentbiodegradability最佳测试条件下，受试物长时间与接种物接触后表现出的生物降解能力。3.2生化需氧量biochemicaloxygendemand；BOD微生物分解有机物所消耗氧的量，可表示为每毫克受试物消耗的氧毫克数（mg/mg）。3.3理论需氧量theoreticaloxygendemand；ThOD根据分子式计算得到的受试物完全被氧化时需要的氧总量，可表示为每毫克受试物消耗的氧毫克数（mg/mg）。4受试物信息试验前应获得下列受试物信息：a)标识信息（通用名、化学名称或IUPAC名、CAS号），化学纯度；b)按照GB/T21845方法测定的水中溶解度；c)按照GB/T22228或GB/T22229测定的蒸气压；d)按照GB/T21854方法测定的吸附系数Koc；2GB/TXXXXX—XXXXe)按照GB/T21855测定的水解作用；f)按照GB/T21796测定的微生物毒性；g)受试物浓度分析方法。5试验原理通过测定生化需氧量（BOD）和受试物残留量分析，评价由改进的MITI试验(Ⅰ)筛选得到的低生物降解性物质的固有生物降解性。以受试物作为唯一的有机碳源，将微生物接种到装有受试物的试验容器中，在微生物对受试物无适应性的前提下，使用自动、密闭的耗氧测定仪（BOD仪）连续测定试验溶液的BOD值。通过BOD测定值与化学分析结果（如测定溶解性有机碳浓度或化学物质的残留浓度等），计算生物降解率。6参比物为检验接种物的活性，应设置参比物试验。宜选择苯胺（新蒸馏）或醋酸钠作为参比物。若使用其他参比物，试验报告中应说明选择依据及有效性判定标准。注1：因苯甲酸钠极易降解，不宜作为检验接7试验系统7.1设备除常规实验室仪器设备外，还需要以下设备：a)BOD测定仪或呼吸计量仪（至少配6个BOD瓶和CO2吸收杯对于挥发性物质，宜采用改进的BOD仪（见附录Ac)膜过滤器（可选7.2接种物7.2.1接种物采集接种物采样点原则上不少于10个使用和排放各种化学物质的场所，如城市污水处理厂、工业废水处理厂、河流、湖泊和沿海。从污水处理厂采集回流污泥1L，从河流、湖泊、海滩采集1L地表水与1L表层土壤。每年分别于3月、6月、9月、10月采样4次。的城市污水处理厂、1个化学工业废水处理厂、3条位于日本北部、中部和南部的河流和2个不同地点的近7.2.2接种物制备预处理：将各采样点采集的样品装入同一容器，搅拌均匀后静置。去除漂浮物，用2号滤纸过滤后以氢氧化钠或磷酸将滤液pH值调为7.0±1.0。3GB/TXXXXX—XXXX曝气培养：将经预处理的混合样品转移至曝气池内曝气培养，曝气结束后静置30min，弃去上清液总体积的1/3，然后加等体积的0.1%的合成污水再次曝气。合成污水配制方式为称取1g葡萄糖、1g蛋白胨和1g磷酸钾溶解于1L水中，以NaOH调节pH值为7.0±1.0。每日重复进行，曝气培养温度为25℃±2℃,持续曝气培养1月后方可用于试验。培养过程控制：为确保得到合格的接种物，应进行以下检查和采取必要的控制措施：——上清液外观：应是澄清的；——活性污泥的沉降：絮凝活性污泥应具有较强的沉降性；——活性污泥的形态：当无絮状物出现时，可增加0.1%的合成污水添加量或增加合成污水的添加次数；——pH：上清液pH值为7.0±1.0；——温度：培养温度为25℃±2℃;——曝气量：加入合成污水后培养液应充分曝气，保持溶解氧浓度大于5mg/L；——微生物群落：在放大100~400倍的显微镜下，应可见大量不同种类的原生动物和云状物。——新鲜和驯化污泥的混合：为了保持新鲜与驯化污泥具有相同的活性，试验前，使用驯化污泥上清液与新鲜污泥上清液滤液等量混合，培养18~24h后方可作为新的接种物；——活性污泥活性测定：应使用参比物质定期（至少每3个月1次）检测污泥活性，特别是在新鲜和驯化污泥混合后（图1），确保与驯化污泥活性一致。图1接种物制备和使用周期示例7.3试验用水使用去除毒性物质（如Cu2+）的高纯去离子水，且有机碳含量不大于受试物浓度的10%，每组系列试验使用同一批水。7.4培养基7.4.1试验培养基贮备液用分析纯试剂制备下列贮备液：a)磷酸缓冲液：称取21.75g磷酸氢二钾（K2HPO4）、8.50g磷酸二氢钾（KH2PO4）、44.6g十二水合磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）和1.7g氯化铵（NH4Cl用水溶解，定容至1L，pH值为7.2。4GB/TXXXXX—XXXXb)氯化钙溶液：称取27.50g无水氯化钙（CaCl2）用水溶解，定容至1L。c)硫酸镁溶液：称取22.50g七水合硫酸镁（MgSO4·7H2O用水溶解，定容至1L。d)氯化铁溶液：称取0.25g六水合氯化铁（FeCl3·6H2O用水溶解，定容至1L。加入0.05mL浓盐酸或0.4g/LEDTA二钠盐缓冲溶液保存。上述贮备液中如果出现沉淀，则需重新配制。7.4.2试验培养基的制备取7.4.1中溶液a），b），c）和d）各3mL，用试验用水稀释并定容至1L。8试验程序8.1组别设计试验中通常设置下列组别：a)瓶1：非生物降解对照（受试物30mg/L+去离子水b)瓶2、瓶3和瓶4：含受试物和接种物的试验组（活性污泥100mg/L（以干重计）+受试物30mg/L+培养基c)瓶5：含参比物和接种物的程序对照（活性污泥30mg/L（以干重计）+苯胺100mg/L+培养基d)瓶6：仅含接种物的接种物空白对照（活性污泥100mg/L（以干重计）+培养基）。8.2受试物预处理若受试物为固体，且在设定的试验浓度下不溶于水，应将受试物充分磨细。若受试物具有挥发性，应充分冷却以减少挥发。必要时，应对受试物进行鉴定。8.3试验操作难溶受试物试验中不能使用助溶剂和乳化剂，可采用研磨或超声分散等适当方式使溶液均质化。试瓶1中只加受试物不加接种物作为非生物降解对照，CO2吸收杯中加入CO2吸收剂，连接好试验装置，检查气密性，开始搅拌，在黑暗、25℃±2℃条件下开始试验，每天检查温度和搅拌器工作状态，连续自动测定溶解氧浓度，并观察试验瓶中内容物的颜色变化，以获得0d～14d或0d～28d的BOD曲线（见图2）。试验结束时，测定各试验瓶溶液的pH值、受试物浓度或中间体的浓度。为确定试验过程中受试物可能发生的变化，如通过挥发或试验容器壁吸附作用造成受试物损失等，不加接种物的受试物处理也应测定。5GB/TXXXXX—XXXXa——适应期；l——对数增长期；m——最大降解率；r——降解通过水平；t——时图2易降解类化合物的降解曲线示例8.4分析方法8.4.1总有机碳分析法a)若受试物溶于水，应同时测定总有机碳残留量。b)从试验瓶中取10mL受试溶液，以3000g速度离心5min，使用总有机碳分析仪测定上清液中总有机碳残留量。8.4.2其他分析方法a)选择适宜的溶剂提取试验溶液中的受试物及中间体或产物（适用时），经适当的预处理（如浓缩）后，使用分析仪器（如色谱仪、光谱仪、质谱仪、原子吸收分光光度计等）测定受试物及中间体或产物（适用时）的残留量。b)对于挥发性受试物，试验结束后应将BOD仪的温度降低至10℃,并至少保持30min（以防止挥发影响），然后开始上述分析。c)对于含氮受试物，若硝化作用确已发生，试验结束时应测定硝酸盐和亚硝酸盐的浓度。9质量控制质量控制条件包括：a)氧消耗量检测限为1mg；b)受试物分析方法灵敏度与回收率应满足试验要求；c)受试物水中浓度/空气中浓度应不低于1，对于挥发性受试物，应采用改进的BOD测定法（附录A）；d)若使用苯胺为参比物，试验进行到7d和14d时，参比物降解率应分别≥40％和≥65%;e)试验结束后，非生物对照组中受试物的残留率应大于或等于10%。注1：对于水溶解度大于100mg/L的受试10数据与报告6GB/TXXXXX—XXXX10.1数据处理a)根据氧消耗量计算降解百分率，按公式（1）进行计算：式中：D——生物降解率，以%表示；BOD——根据BOD曲线测定的受试物生化需氧量，单位为毫克（mgB——根据接种物空白BOD曲线测定的氧消耗量，单位为毫克（mgTOD——受试物完全氧化需要的理论需氧量，单位为毫克（mg）。b)根据受试物分析测定结果计算降解百分率，按公式（2）进行计算：式中：Sa——生物降解试验结束后受试物的残留量，单位为毫克（mgSb——2个空白对照中受试物的平均残留量，单位为毫克（mg）。10.2理论需氧量的计算对于有机化合物，通常在好氧生化条件下，C转化为CO2，H转化为H2O，N转化为NH3/NO2（NO3），硫转化为SO2，卤素X转化为X-1，那么化合物CcHhXxNnOoPpSs理论需氧量TOD计算，按公式（3）进行计算：若发生硝化作用时，应基于形成硝酸盐的降解方式来计算TODNO3，按公式（4）进行计算：式中：c——化合物分子中碳原子个数；h——化合物分子中氢原子个数；cl——化合物分子中氯原子个数；n——化合物分子中氮原子个数；p——化合物分子中磷原子个数；s——化合物分子中硫原子个数；MW——化合物相对分子质量；若硝化作用确已发生，试验结束后应测定硝酸盐和亚硝酸盐的浓度。10.3结果报告试验报告应包括以下内容。a)受试物：——基本信息，包括名称、分子式、分子量、纯度、杂质等；——理化性质；——光谱数据。7GB/TXXXXX—XXXXb)试验条件：——接种物：状态、取样地点与浓度；——受试物浓度；——试验周期与温度；——程序改变的原因及解释说明。c)化学分析：——前处理；——仪器分析条件；——回收率；——中间产物分析。d)结果：——BOD曲线和仪器名称；——BOD（mg——B（mg——Sa（mg）；——Sb（mg）；——TOD（mg——根据BOD的降解百分率；——根据化学分析的降解百分率；——受试物的色谱或光谱分析结果。e)结果讨论。8GB/TXXXXX—XXXX基于库仑计的BOD测定仪A.1基于库仑计的BOD测定仪的构成库仑计是利用电化学过程测定微生物氧消耗量的仪器。日本大仓电子有限公司生产的BOD测定仪的结构如框图A.1所示，由6个样品单元、测量单元、监控单元和记录组件四部分组成。对于改进的BOD仪，阴影部分应用毛细管代替。当测定挥发性物质时，电解瓶和反应瓶之间用毛细管链接。①培养瓶，②磁力搅拌器，③CO2被吸收杯，④电子压力图A.1基于库仑计的BOD测定仪构成示意图A.2测定原理培养瓶中的受试体系在连续搅拌下反应，反应过程中，水相中的溶解氧逐渐消耗，培养瓶上部的O2溶解进入水相，而产生的CO2释放进入瓶中上部空间。当CO2被碱石灰吸收时，培养瓶上部的氧压和总压力减少。压力的下降通过电子压力计转换成电信号，经放大器放大开启继电器，启动同步马达。同时，在恒电流