化学品 体外哺乳动物细胞染色体畸变试验方法 征求意见稿

1GB/T××××—202×化学品体外哺乳动物细胞染色体畸变试验方法本文件规定了化学品体外哺乳动物细胞试验方法的范围、术语和定义、试验基本原则、试验方法、试验数据和报告。本文件适用于化学品体外哺乳动物细胞染色体畸变试验。2规范性引文本文件没有规范性引用文件。3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1术语和定义3.1.1非整倍体aneuploidy正常二倍体（或单倍体）染色体数目中缺少或增加一条或多条，但不是整套染色体（多倍体）的增减。3.1.2染色单体断裂chromatidbreak染色单体的不连续，其中有一条明显的不对称染色单体。3.1.3染色单体裂隙chromatidgap单个染色单体上出现的无染色质的区域，其宽度小于染色单体的横截面的宽度。3.1.4染色单体型畸变chromatid-typeaberration表现为染色单体断裂或染色单体间断裂和重接的染色体结构损伤。3.1.5染色体型畸变chromosome-typeaberration表现为两条染色单体在相同位点的断裂或断裂重接的染色体结构损伤。3.1.6染色体断裂剂clastogen任何能引起细胞或真核生物染色体结构畸变的物质。3.1.72GB/T××××—202×内复制endoreduplicationDNA复制的S期末，细胞核没有进入有丝分裂，而开始另一个S期的过程，其结果是染色体具有3.1.8基因毒性genotoxic一个包含所有类型的DNA或染色体损伤的总称，包括断裂、缺失、加合、核苷酸修饰和连接、重排、基因突变、染色体畸变和非整倍体。并不是所有类型的基因毒性效应都会导致突变或稳定的染色体损伤。3.1.9有丝分裂指数mitoticindex有丝分裂的细胞数量与总细胞数量之比，用来衡量增殖状态细胞数量的指标。3.1.10数目畸变numericalaberration染色体数目的改变，不同于所用细胞的正常染色体数目。3.1.11多倍体polyploidy单倍体染色体（n）数目的倍数，但不包括二倍体（即3n，4n等）。3.1.12相对细胞增长数relativeincreaseincellcounts，RICC与试验样品接触培养的细胞数目的增加与未处理培养物细胞数日增加的比值，以“%”表示。3.1.13相对群体倍增数relativepopulationdoubling，RPD与试验样品接触培养的细胞倍增数与未处理培养物的细胞倍增数的比值，以“%”表示。3.1.14结构畸变structureaberration显微镜下观察到的细胞分裂中期的染色体结构的改变，例如缺失、断裂、内交换或者相互交换。4试验基本原则除非使用的细胞具有足够的代谢能力，否则人类或其他哺乳动物来源的细胞需要暴露在有或无外源性代谢激活源的试验化学品中。通常将培养细胞与受试物接触一定的时间后，再用中期分裂相阻断剂（如秋水仙素或秋水仙胺）进行处理，通过对处于有丝分裂中期的哺乳动物细胞的染色体畸变情况进行分析，评价试验样品潜在的致畸变性。5试验方法5.1准备5.1.1细胞3GB/T××××—202×可选用的细胞包括中国仓鼠卵巢细胞（CHO中国仓鼠肺细胞V79，中国仓鼠肺细胞（CHL）以及包括人或其他哺乳动物的外周血淋巴细胞在内原代细胞。当使用原代细胞时，在可行的情况下宜考虑使用来自人类的原代细胞，并根据人类伦理原则和规定进行抽样。人外周血淋巴细胞宜来自年轻（约18岁-35岁）、无吸烟史、无已知疾病且最近未接触遗传毒性物质（如化学试剂、电离辐射）的献血者以确保染色体畸变的背景发生率低且一致。5.2培养基及培养条件宜使用合适的培养液和培养条件（培养容器、湿化的5%CO2，培养温度37℃)来维持所培养细胞的生长。需要定期检查细胞系模态染色体数目的稳定性和支原体污染情况，否则不宜使用。细胞应置于液氢中冷冻保存。实验室宜测定细胞系或原代细胞的正常细胞周期时间，并与公开发表的细胞特征一致。5.3培养物准备5.3.1细胞系：细胞传代时，以一定密度接种在培养基中，以使悬浮液或单层细胞在收获时间之前继续呈指数增长（例如，单层细胞生长应避免汇合）。5.3.2淋巴细胞：用抗凝剂（例如肝素）处理过的全血或分离的淋巴细胞在有丝分裂原（例如用于人类淋巴细胞的植物血凝素（PHA）下培养，以便在暴露于测试化学品之前诱导细胞分裂。5.4代谢活化在加入或者不加入代谢活化系统的条件下，细胞暴露于受试物。当细胞内源性代谢能力不足时，应使用外源性代谢系统。最常用的活化系统是经酶诱导剂处理的，如Aroclor1254或苯巴比妥和β-萘酚黄酮的联合诱导后的啮齿动物（通常是大鼠）的肝脏中制备的加有辅助因子的后线粒体组分（S9）。S9浓度通常为1~2%（v/v但可能在最后的试验培养基中最大增加到10%（v/v）。S9的使用可以减少细胞有丝分裂的指数，接触期间宜避免使用钙络合产品。外源性代谢激活系统或代谢诱导剂的类型和浓度的选择可能会受到所测试物质的类别的影响。5.5受试物的准备固体试验化学品应在适当的溶剂中制备，并在细胞处理前进行适当稀释。液体测试化学品可直接添加到测试系统中，或在处理测试系统之前进行稀释。对于气体或易挥发性试验化学品可以对标准规程进行适当修改后再进行测试，例如在密封培养容器中进处理。除非有资料证实储存受试物是稳定的，否则应使用新鲜制备的受试物。5.6试验条件5.6.1溶剂溶剂的选择应在不影响试验进行的情况下优化试验物质的溶解度，例如改变细胞生长，影响试验化学物质的完整性，与培养容器发生反应，损害代谢激活系统等。在可行的情况下，首先考虑使用水溶液溶剂（或培养基）。目前公认的溶剂如水或二甲亚砜。通常，在最终接触浓度中有机溶剂浓度不得超过1%（v/v水溶剂（盐水或水）不得超过10%（v/v）。如果使用的溶剂没有确定的标准（例如乙醇或丙酮则使用时应有数据支持，表明其与试验化学品的相容性、试验系统以及所使用的浓度下其没有遗传毒性。如果缺乏支持性的数据，那么重要的是纳入未经处理的对照组，以证明所选溶剂不会产生有害或造成染色体断裂的作用。5.6.2染毒剂量的选择5.6.2.1在正式试验中，应使用适当的细胞死亡和生长指标来确定受试物有无代谢激活的细胞毒性。4GB/T××××—202×5.6.2.2相对群体倍增数（RPD）或者相对细胞增长数（RICC）是细胞遗传学试验中评估细胞毒性的常用方法。在长期接触的情况下，如果开始接触样品后的采样时间超过1.5个正常细胞周期，则RPD可能会低估细胞毒性大小，而在这种情况下选择用RICC或重新用RPD在1.5个正常细胞周期内进行评估。5.6.2.3当确定试验所需的最高剂量浓度时，应当考虑由于对细胞产生高毒性，能在培养基中产生沉淀，或者由于pH和渗透压的显著改变而引起的假阳性。如果加入试验样品使培养液的pH发生明显的变化，则可以调节最终处理培养液的pH，以避免产生假阳性结果。5.6.2.4应评估至少三个满足可接受标准（适当的细胞毒性、细胞数量等）的测试浓度（不包括溶剂和阳性对照）。无论细胞类型是什么（细胞系或淋巴细胞的原代培养物在每个测试浓度下都可以进行单一或平行培养物的处理。对于显示很少或没有细胞毒性的试验化学品，大约2至3倍的浓度间隔通常是合适的。在发生细胞毒性的情况下，选择的测试浓度应涵盖产生细胞毒性的浓度范围，包括中度和极少或没有细胞毒性的浓度。许多受试物表现出陡峭的浓度响应曲线，为了获得低和中等细胞毒性的数据或详细研究剂量响应关系，有必要使用更紧密的浓度和/或三个以上的浓度，特别是需要对实验进行重复的情况下。5.6.2.5如果最大浓度的选择是基于细胞毒性，推荐细胞毒性参数实现55±5%的细胞毒性作为最高浓度进行使用（即细胞系的RICC和RPD降低，淋巴细胞的有丝分裂指数降低至阴性对照的45±5%但是在解释仅在55±5%细胞毒性范围内发现阳性结果时应小心。5.6.2.6对于难溶解的受试物，如果在低于最低溶解度时仍然没有细胞毒性，那么所使用的最高浓度应在受试物处理结束时产生浑浊或肉眼或倒置显微镜可见的沉淀物。即使细胞毒性在最低溶解度以上的浓度发生，建议只在产生浑浊度或有可见沉淀物的浓度下进行测试，因为沉淀物可能会产生假阳性。在使用产生沉淀的浓度时，应小心确保沉淀不会干扰试验的进行(例如染色或评分)。因此，推荐在试验前测定培养基中的溶解度。5.6.2.7如果没有观察到沉淀或细胞毒性，则最高测试浓度应对应于10mM、2mg/mL或2µl/mL，以最低者为准。当测试化学品的成分不确定时，例如成分未知或可变的物质、复杂反应产物或生物材料（即UVCBs）等环境提取物等，在没有足够的细胞毒性的情况下，可能需要提高处理浓度（如5mg/ml或者增加每种成分的浓度。但应该注意的是，这些要求对人类用药可能有所不同。5.6.3对照5.6.3.1每个试验均应在加入和不加入代谢活化系统的条件下，设置平行的阴性（溶剂）和阳性对照。在使用活化代谢系统时，阳性对照物应是需要经代谢活化过程才显示突变作用的化学物。5.6.3.2阳性对照应使用已知的断裂剂，其染毒水平应该有明显超过本底值的且可重复阳性结果，以证明实验室在所用测试方案的条件下具有检测染色体断裂的能力并确定代谢活化系统的有效性。阳性对照的浓度应合理设置，最好是效果既明显又不会让阅片者立即发现其为阳性对照的标本片。下面的表1给出了一些阳性对照的例子。表1推荐阳性对照选择的参比物质表1推荐阳性对照选择的参比物质（续）5GB/T××××—202×5.6.3.3也可使用其他合适的阳性对照物，如果有可能，可利用与受试物化学结构相关的阳性对照物。5.6.3.4每个收样时间都应该包括同期阴性对照，指的是培养液中仅含有溶剂，不含有受试物，并与处理组相同的方法处置的培养物。5.7试验步骤5.7.1染毒在加入或者不加入代谢活化系统的条件下，给处在增殖期的细胞染毒受试物，淋巴细胞应该在刺激有丝分裂后约48小时后开始染毒。5.7.2收样时间在首次试验时，细胞应该在加入或者不加入代谢活化系统条件下染毒3h至6h，并在开始染毒后约1.5个正常细胞周期时收样。如在加入和不加入代谢活化系统的条件下均为阴性结果，则应再进行一次不加入代谢活化系统的实验，并延长染毒时间至1.5个正常细胞周期时收样。一些化学品在染毒或者收样时间长于1.5个正常细胞周期时更容易检测。5.7.3染色体标本的制备在收样前1-3h加入秋水仙素或秋水仙碱，收集每个细胞培养物并分别制备染色体。染色体的制备包括细胞的低渗处理、固定和染色。在单层细胞中，有丝分裂细胞（可识别为圆形并从表面分离）可能在3-6h处理结束时出现。这些有丝分裂细胞很容易被分离，所以当含有测试化学物质的培养基被去除时，它们就会丢失。如果有证据表明有丝分裂细胞的数量与对照相比有大幅度增加，表明有丝分裂可能被阻滞，那么应该通过离心收集细胞并加入培养物中，以避免在收获时丢失处于有丝分裂状态且有染色体畸变风险的细胞。5.7.4染色体分析5.7.4.1包括阴性和阳性对照在内的所有涂片，均应在进行染色体畸变显微镜分析之前独立编号。由于固定过程可导致一定数量的中期分裂细胞破损而丢失染色体，因此，其数目应等于各类细胞模式数目的2n±2（modelnumber±2每个浓度组和对照组至少计数300个分布良好的中间分裂相细胞。当有平行皿的培养物涂片时，300个细胞应该在复制中平均分配。当观察到大量的染色体畸变细胞时，可以适当减少中期分裂相细胞数目。5.7.4.2应单独记录染色单体和染色体畸变类型，并按照亚型进行分类（断裂或者交换以及记录出现的多倍体和内含子重复频率。实验室操作流程应确保由训练有素的评分员进行染色体畸变分型，并根据情况进行过同行监督审查。6试验数据和报告6GB/T××××—202×6.1数据处理6.1.1由于试验对象是细胞，因此应评价有染色体畸变的细胞的百分率，应列出染毒组和对照组不同亚型（断裂或交换）染色体结构畸变的数目和频率。可报告染色单体裂隙但是不计入总畸变频率中。报告中还应包含发现的多倍体及核内复制的频率。6.1.2应记录整个实验过程中所有测定的染毒组和对照组的细胞毒性的结果。6.1.3应提供各个培养物的资料，且所有资料以表格形式列出。6.2结果评价6.2.1阳性结果的判断标准：与同期阴性对照相比，至少一种试验浓度在统计学上显著增加；如有多组剂量试验时，染色体畸变细胞数的增加与浓度相关或含染色体畸变的细胞数的增加是可重复的；任何一个处理组超出了历史阴性对照数据的分布范围（如95%的控制限值）。此外，应首先考虑结果的生物学意义，可利用统计学方法帮助评价试验结果，但统计学显著性不应该是确定阳性结果的唯一标准。6.2.2结果不符合上述标准的受试物可认为在本系统中无诱发染色体畸变的作用。6.2.3如果反应不是上述描述中明确的阳性或者阴性结果，为了进一步验证，应通过专家判断或者进一步重复试验来评估，也可增加镜检细胞数目或改进试验条件（例如浓度间隔，其他代谢活化条件）进行重复试验。在极少数的情况下，如果进一步试验以后，仍然无法得出阳性或者阴性的结果，则改受试物的结果被认为是不确切的或可疑的。6.2.4体细胞数目的增加可能表明，受试物可能具有潜在的抑制有丝分裂的过程，并诱发染色图数目畸变。核内复制染色体的细胞数量增加可能表明，受试物具有抑制细胞周期进展的作用。6.2.5体外染色体畸变试验阳性结果表明，受试物可诱发体外培养的哺乳动物体细胞染色体结构畸变。阴性结果则表明，在本实验条件下受试物不具有诱发体外培养的哺乳动物体细胞染色体结构畸变的作用。6.3试验报告试验报告应包括下列内容：a)受试物——名称、规格型号和批号及有效期（如已知——稳定性（如已知——受试物在溶剂中的溶解度及稳定性（如已知——受试物在培养液中的PH、渗透压以及沉淀（如已知——受试物是单组分物质时，需提供物理性质、水溶性和其他理化性质及化学鉴定，如IUPAC或CAS名称、CAS编号、SMILES或InChI代码、结构式、纯度、杂质的化学鉴定等；——受试物为多组分物质、UVB及混合物时，需提供上述的化学性质以外，还需提供各成分的定量及相关的化学性质。b)溶剂——溶剂选择的依据；——在最终细胞培养液中占比。c)细胞——细胞的类型及来源；——核型特征及细胞类型的适用性；——无支原体污染；——细胞周期长度、倍增时间及增殖指数；7GB/T××××—202×——供血者的性别、年龄和相关信息，全血或分离的淋巴细胞，有丝分裂源的使用；——细胞培养的代数；——细胞培养的方法；——模式（model）染色体的数目。d)试验条件——中期分裂相阻断剂名称、浓度和细胞处理时间；——受试物在培养基中的最终浓度；——浓度选择的依据及试验的平行数，细胞毒性资料（如有——细胞培养液的组成，CO2体积分数（适用时）和湿度水平；——培养基中添加的溶剂和受试物的浓度或体积；——培养温度；——培养时间；——染毒时间；——收样时间；——染毒时细胞的密度（适用时——代谢活化系统的类型和组成（S9的来源，S9混合物的制备方法、S9混合物以及在最终培养液的浓度或体积；S9的质量控制，适用时——阳性对照和阴性对照的浓度；——涂片的制备方法和染色方法；——染色体畸变计数的标准；——结果偏差的标准；——被分析为细胞分裂中期的数量；——细胞毒性的测试方法；——阳性、阴性及可疑结果的判断标准；——测定pH、渗透压和沉淀的方法。e)结果——当使用细胞系时，处理时的细胞数量及每次收样时的细胞数量；——细胞毒性的测定结果；——细胞周期长度、倍增时间及增殖指数的信息；——出现沉淀的方法及时间；——细胞畸变的类型，包括裂隙；——试验组和对照组中计数的细胞数量、染色体畸变的细胞数量含或不含裂隙的细胞类型；——细胞倍性的变化（多倍体细胞和核内复制的细胞——剂量-反应关系（如可能——阴性和阳性对照的信息；——历史阴性和阳性资料，包括分布范围、平均值和标准差、95%控制限值；——统计方法以及P值。6.4结果的讨论6.5结论8GB/T××××—202×（资料性）细胞毒性评