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DB21DB21/T2619—2016传染性造血器官坏死病毒LAMP检测方法Loop-mediatedisothermalamplificationdetectionmethodforInfectioushaematopoieticnecrosisvirus辽宁省质量技术监督局发布1DB21/T2619—2016本标准主要起草人：肇慧君，胡强，张雪，刘钊，栾慎顺，李2DB21/T2619—2016环介导恒温扩增（loop-mediatedisothermalamplification本标准适用于IHNV病原的流行病学调查、诊件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用GB/T6682分析实验室用水规SN/T2123-2008出入境动物检疫实验样品EDTA：乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraaceticHEPES：羟乙基呱嗪乙硫磺酸[4-(2-Hydroxyethyl)RNA：核糖核酸（ribonucleiLAMP：环介导恒温扩增（Loop-mediatedBst酶：BstDNA聚合酶（大片段）[BstDNApolymerase(largefraAMV逆转录酶：AMVreversetranscrdNTP：脱氧核糖苷三磷酸（deoxyribonucleosidetrip4试剂、仪器和耗材）：3DB21/T2619—2016）：）：）：4.1.2BstDNApolymerase：8U/μL，-20℃保存，不要反复冻融或温度剧烈变化。4.1.3AMV逆转录酶：15U/μL，-20℃保存，不要反复冻融或温度剧烈4.1.5Rnaseinhibito4.1.10乙醇：分析纯，使用前预冷到-20注：除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水；所有试剂均用无采样、样品处理及检测过程所涉及的实验操作，应遵守SN/T2123-2008的有），4DB21/T2619—2016胞单层的96孔板中，每孔的细胞单层最多接种100μL稀释液。15℃~20℃吸附0.5h～1h后，加入M199细的细胞培养中出现细胞病变（CPE应立即进行鉴定。如果除阳性对照细或抽真空干燥，最后加10μLDEPC水溶解后，作为LAMP反应模板。112215DB21/T2619—2016-1-按照表1所述配制反应体系：63℃恒温扩增45min，80℃2min使在上述反应管中加入2μL显示液，轻轻混匀并在黑色背景下观察。显色液优选为荧光染料SY在空白对照和阴性对照反应管液体为橙色，阳性对照反应管液体呈绿6DB21/T2619—2016试剂的配制A.1胰酶-EDTA混合消化液M199培养基，按说明书的要求配制，然后加入10%的胎牛血清，抽滤除菌，4℃保存。开放系统使A.3CTAB溶液按2%CTAB，1.4mol/LNaCL，20.0mmol/LEDTA，20.0mol/LTriA.4抽提液1A.5抽提液2氯仿/异戊醇，将氯仿和异戊醇按24:1的比例混合，密7DB21/T

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