DB21T 2209-2013 海绵种属分子生物学鉴定技术规程

ICS65.150B51DB21DB21/T2209—2013海绵种属分子生物学鉴定技术规程TechnicalSpecificationofIdentifyingSpongethroughMolecularBiologyTechniques辽宁省质量技术监督局发布IDB21/T2209—2013本标准是按照GB/T1.1—2009给出的规则起草的。本标准由大连海洋大学提出。本标准由大连市质量技术监督局归口。本标准主要起草单位：大连海洋大学、中国科学院大连化学物理研究所本标准主要起草人：付晚涛、郑长波、曹旭鹏、苏延明、宋悦凡、潘勍宇、安宗福。本标准于2013年**月**日首次发布。1DB21/T2209—2013本标准规定了海绵种属分子生物学鉴定的总则、海绵样品采集与保存、海绵种属鉴定方法。本标准适用于海绵的样品采集、保存、处理和种属分子生物学鉴定方法。2术语和定义下列术语和定义适用于本文件。2.1海绵2.2海绵分子条码海绵的细胞色素氧化酶亚基Ⅰ（cytochromeoxidasesubunitⅠ,简称COI）的DNA序列为海绵的保守基因序列信息，作为海绵分子条码。3.1原理海绵细胞色素氧化酶亚基Ⅰ（COI）的DNA序列为海绵的保守基因序列，作为海绵分子条码，用于鉴定海绵种属。通过分子生物学技术——聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction，简称PCR）扩增海绵的COI基因部分序列，测序后与已经鉴定海绵的COI基因序列比对，以此鉴定海绵的种属。3.2仪器与设备——野外生物样品保存箱或泡沫保温箱；——高速低温冷冻离心机；——水浴锅；——-80℃冰柜。3.3试剂与材料——无水乙醇（分析纯——细胞裂解缓冲液（10mmol/LTris-Cl，pH8.0；1mmol/LEDTA，pH8.0；0.1%(m/V)SDS——异丙醇（分析纯2DB21/T2209—2013——醋酸甲溶液（60ml5mol/L醋酸钾；11.5ml冰醋酸；28.5ml超纯水——细胞裂解液（20mmol/LTris-Cl，pH7.6——蛋白酶K（20mg/ml——TE缓冲液（pH7.6100mol/LTris-Cl，pH7.6；10mmol/LEDTA，pH8.0——超纯水；——PCR酶(5U/μL)；高压灭菌10min）。4海绵样品采集与保存4.1对于潮间带海绵，在海水退潮后，先拍照或摄像，再用金属或木质的小板采集海绵样品于塑料采样瓶中，立刻加入75%乙醇浸没海绵样品并超过2cm以上，然后放入装有冰袋的泡沫保温箱或野外生物样品保存箱，用于分子生物学鉴定。4.2对于潮下带海绵和深海海绵，采样器采集海绵后放入塑料采样瓶中并在瓶中装满样品附近的海水。装有海绵样品和海水的样品瓶被带上船或带上岸后，倒掉采样瓶中海水，立刻加入75%乙醇浸没海绵样品并超过2cm以上，然后放入装有冰袋的泡沫保温箱或野外样品保存箱，用于分子生物学鉴定。4.3上述样品均可在4℃条件下保存1天。4.4海绵样品采集与保存记录于《海绵资源调查采样表》（详见附录A）。5海绵种属鉴定方法以海绵的COI基因序列为鉴定海绵种属的分子生物学信息。5.1海绵DNA提取与纯化5.1.1取约0.5g保存在乙醇中的海绵样品，放入事先用液氮冷却过的研钵中，加入液氮研磨海绵样品成粉末状。5.1.2将研磨成粉末的海绵样品移入装有600μL细胞裂解缓冲液的聚丙烯离心管中混匀，加入3μL蛋白酶K，在55℃水浴锅上放置3h以上。5.1.3从水浴锅取下装有海绵的离心管，放置室温后，加入200μL醋酸钾溶液，振荡、混匀。5.1.4在4℃离心（12,000rpm）3min,将上清液转移至装有600μL异丙醇的新的聚丙烯离心管中，振荡、混匀，然后在室温离心（12,000rpm）3min。5.1.5吸去上清液，加入600μL乙醇（70%），振荡混匀，在室温离心（12,000rpm）3min（重复此过程一次）。5.1.6吸去上清液，在空气中干燥DNA沉淀15min；将DNA沉淀溶解于300μLTE缓冲液（pH7.6作为海绵基因组DNA提取纯化液。5.1.7海绵基因组DNA提取纯化液保存于-80℃。5.2海绵COI基因序列片段的PCR扩增与测序3DB21/T2209—20135.2.1使用扩增海绵COI基因序列片段的特异引物对（LCO1490:GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG；COX1-R1:TGTTGRGGGAAAAARGTTAAATT）。5.2.2在100μLPCR反映管中加入如下试剂：10×PCR缓冲液10μL、引物LCO1490（20pmol/L）0.5μL、引物COX1-R1（20pmol/L）0.5μL、海绵基因组DNA提取纯化液10μL、Taq酶(5U/μL)0.5μL、超纯水定容至50μL。5.2.3把此PCR反应管放在普通PCR仪中，并按照如下条件在进行PCR扩增海绵COI基因序列片段的反应：一个循环反应（94℃2min、50℃1min、72℃2min），30个循环反应（94℃50秒、50℃50秒、72℃2min），最后在72℃停留10min，结束PCR反应。5.2.4从PCR仪中取出扩增的海绵基因片段产品，经测序后获得海绵COI基因片段DNA序列信息。5.3海绵分子生物学种属鉴定5.3.1新测序的海绵COI基因DNA片段序列在在线网站（/）进行核苷酸（nucleotide）序列比对，初步获知海绵种属信息；5.3.2根据初步获得的海绵种属信息，根据国际公认的已鉴定海绵COI基因DNA片段序列信息（在线网站：/）确认海绵种属，COI基因DNA片段序列一致性不低于99%的海绵被鉴定为同一种属海绵，记下种属名，记录于《海绵分子生物学鉴定记录表》（详见附录B）。5.3.3对于海绵COI基因DNA片段序列一致性低于99%的海绵，作为暂时不能鉴定海绵，记录于《暂时不能鉴定海绵的记录表》（详见附录C）。4DB21/T2209—2013（资料性附录）海绵资源调查采样表采样点经度纬度；采样人；水深水温盐度；序号标本瓶号海绵样品记录名称数量备注1234567记事：采样记录校对5DB21/T2209—2013（资料性附录）海绵分子生物学鉴定记录表鉴定人；地点；分子生物学仪器的名称型号；序号标本瓶号海绵样品记录名称海绵分子生物学鉴定结果备注123456789记事：采样记录校对6DB21/T2209—2013