DB51T 1098-2010 牛奶中磺胺二甲氧嘧啶残留检测方法-酶联免疫吸附测定(ELISA)法　　

DB51/T1098—2010牛奶中磺胺二甲氧嘧啶残留检测方法一四川省质量技术监督局发布IDB51/T1908—2010前言 错误!未定义书签。 12规范性引用文件 1 14测定方法 15测方法灵敏度、准确度、精密度 3本标准由四川省畜牧食品局提出并归口。本标准由四川省质量技术监督局批准。本标准起草单位：四川省兽药监察所、四川省兽药残留监控中心。本标准主要起草人：吴晓岚、程江、彭莉、岳秀英、熊浩山、官艳丽、王海波。11范围凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。3制样3.2样品的保存4测定方法4.2试剂和材料4.2.1十二水合磷酸氢二钠(Na₂HPO4.12H₂O),二水合磷酸二氢钾(KH₂PO4.2H₂O),氯化钠(NaC1),氯化钾(KC1)。4.2.20.02MPBS缓冲液称取5.36g十二水合磷酸氢二钠、0.20g二水合磷酸二氢钾、8.00g氯化钠和0.20g氯化钾加去离子水溶液定容至1L。4.2.3磺胺二甲氧嘧啶试剂盒：2℃~8℃保存。(采用官方备案的试剂盒)4.2.3.196孔板酶标板8条×12孔：包被有磺胺二甲氧嘧啶偶联抗原。4.2.3.5底物溶液A。4.2.3.6底物溶液B。24.2.3.7浓缩洗涤液临用前用水稀释二十倍作为洗涤液。4.2.3.8浓缩复溶液临用前用水1:1稀释。4.2.3.9终止溶液。4.3仪器和设备4.3.1酶标仪(配备450nm滤光片)。4.3.3分析天平感量0.0001g。4.3.4漩涡混合器。4.3.5氮吹仪。4.3.6冷冻离心机。4.3.7振荡器。4.3.9微量移液器单道50μL,100μL,1000μL多道50μL-250μL。4.4测定步骤4.4.1试料的制备试料的制备包括：——取制备后的供试样品，作为供试试料。——取制备后的空白样品，作为空白试料。——取制备后空白样品，添加适宜浓度的标准溶液作为空白添加试料。取制备后的试样5.0mL于离心管中，3000r/min,10℃离心10min,吸除上层脂肪；取1ml离心后的缓冲液(见配液3)按1:19的体积比进行稀释(即20μl牛奶+380μ10.02MPBS缓冲液);最后取20μl用于分析。4.4.3样品测定程序(20℃~26℃条件下操作)4.4.3.1使用前将试剂盒置于室温(20℃~26℃)平衡30min以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀。取出需要数量的酶标板微孔条插入框架中，将不用的微孔条放入自封袋，保存于2℃~8℃。将样品和标准品对应微孔按序编号，每个样品和标准品均需做两个平行实验。4.4.3.2加入50μL标准溶液或试样溶液到微孔底部，随即加入酶标二抗50μ1/孔，再加入抗体工作液50μl/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜封板，25℃温箱中避光反应60min。4.4.3.3加入50μL底物溶液A和50μL底物溶液B到微孔中，轻轻振荡混匀25℃避光环境显色30min。4.4.3.4加入50μL终止液到微孔中，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处，测定每孔吸光度值(OD4.5结果计算和表述所获得的标准或样品吸光度值的平均值除以第一个标准(0标准)吸光度值的平均值再乘以100%,得到以百分比给出的吸光度值，以式(1.1)表示：式中：B—为标准溶液或供试样品的平均吸光度值；Bo—为零浓度标准溶液的平均吸光度值。以X轴为标准溶液中磺胺二甲氧嘧啶浓度(μg/L)的自然对数，Y轴为百分吸光度值，在半对数坐标纸上绘制标准曲线图。相对应的供试样品的浓度(μg/L)可以从标准曲线上查出。也可以求出回归曲3DB51/T1908—2010线的方程，计算未知样品中磺胺二甲氧嘧啶的浓度。如果有专业计算机软件可直接求出供试样中磺胺二甲氧嘧啶的浓度。注：检测结果小于20.0μg/L时，可判为未检出，大于20.0μg/L时，判为可疑，需用确证法确认。本方法在牛奶中磺胺二甲氧嘧啶的最低检测限为