2024牡蛎徐氏拟裸茎吸虫荧光定量 PCR 检测方法

PCR 范 缩略 试 样 结果判 安 附 本文件适用于牡蛎科寄生徐氏拟裸茎吸虫的检测GB/T6682GB19489实验室生物安全通用要求SN/T1193基因分析检测实验室技术要求SC/T7103水生动物产地检疫采样技术规范COIc氧化酶第一亚基（CytochromecoxidasesubunitDEPC：焦炭酸二乙酯（DiethylCt值：循环阈值（CyclethresholdEDTA：乙二胺四乙酸（EthylenediaminetetraaceticPCR：聚合酶链式反应（PolymerasechainTAE：Tris、乙酸（Aceticacid）和EDTAEB：溴化乙锭（EthidiumGB/T668250×TAEA.1.110A.1.2μg/μLRNaseA.2.275%A.2.3PCRSYBRGreenPremixExTaqIITaqDNA聚合U/μLmmol/LdGTPSYBRμMμM引物COI-QF：GGTTGATGTTAAGACTTCGG，-20℃DNA2×PremixTaqDNA聚合酶：生化试剂，-20℃95℃rpm300V1.5mL200μLPCR反应管（A.2.1处理，或其它等效产品RNase的微量加样0.001g、组织研磨器、离心机（12000rpm、微波炉。SC/T71034℃低温环境下离水运输，用湿毛巾覆盖。实验室接到牡蛎样品后将贝壳表RNase2mL冻存管中，液氮冷冻。100mg1.5mLRNase1mLTRIzol5min200μL15sec5min12000rpm4℃15min1.5mLRNaseμL12000rpm4℃10min，弃去上清，RNA1mL75%乙醇，轻轻颠倒洗涤沉淀，7500g4℃5minRNA5min～10min30μL~250μLRNaseRNA表 10μL5×PrimeScript2PrimeScriptRTEnzymeMix0.5OligodTPrimer（500.525Random6mers（1000.525500RNaseFree补至105sec；4℃加入40μL～90μL表 20μL2×PermixTaqDNA10检测引物COI-qF（1021检测引物COI-qR（10212补至201×TAE电泳缓冲液，使液面刚刚没过凝胶。9μLPCR1μL10DNA分子120V30min~40min表 20μLSYBRGreenPremixExTaq10检测引物COI-qF（1010.5检测引物COI-qR（1010.52补至20PCRPCRPCR仪，按照以下反应参数设置并运行仪器：95℃30sec；95℃5sec，60℃30sec，40个循环。PCR（SYBR法）阴性对照无Ct值或Ct值≥33，且无特异性扩增曲线；阳性对照Ct值＜30，实验室安全防护按GB/T19489检测过程中防污染措施按照SN/T1193 录0.5mol/LEDTA-Na2溶液，pH 186.1灭菌去离子 8005mol/L氢氧化钠溶 调pH至1000mL，121℃，15min 242冰乙 57.10.5mol/LEDTA溶液，pH8.0 100mL灭菌去离子水加至1000mL，121℃，15min灭菌备用。用时用灭菌去离子水稀释至1×使用。聚蔗 25灭菌去离子 100溴酚 0.1EB（10溴化乙 20灭菌去离子 20.5μg/mL2.5%琼脂 2.5 100,50℃~55℃EB（10μgμL）5μL轻轻晃min，取RNaseRNase加样器吸头等塑料用具应无RNase。操作过程中应自始至终戴一次性橡胶或乳