(高清版)DB22∕T 2049-2014 动物源性饲料中鸭源性成分测定PCR方法　　

Determinationofduckderive2014-02-28发布2014-04-30实施I本标准按照GB/T1.1-2009和GB/T20001.4-2001给出的规则起草。本标准由吉林省质量技术监督局提出并归口。本标准主要起草单位：吉林省产品质量监督检验院、国家农业深加工产品质量监督检验中心、中华人民共和国吉林出入境检验检疫局。本标准主要起草人：史艳宇、刘金华、邴炜、王莹、周亮、吕航、郎乐、张庆波、宫国强。1件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测3术语和定义4原理对样品进行DNA提取，通过PCR扩增，检测鸭特5.1鸭源性成分检测用引物(对)序列为：5.3dNTP:dATP(deoxyadenosinetriphos脱氧鸟苷三磷酸)、dCTP(deoxycytidinetriphosphate,脱氧胞苷三磷酸)、dTTP(deoxythymidinetriphosphate,脱氧胸苷三磷酸)。5.4动物基因组DNA提取纯化试剂盒。5.5RNaseA酶：冻干品，不含DNase。5.6蛋白酶K:冻干品。5.7三羟甲基氨基甲烷(Tris)。25.9三水合乙酸钠、氯化钠。5.10十六烷基三甲基溴化铵(cetyltrithylammoniumbromide,CTAB)。5.11乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA-Na₂·2H₂O)。5.1275%乙醇、异丙醇、三氯甲烷、异戊醇、正己烷等有机试剂。5.1310×PCR缓冲液：含200mmol/LTris-HCI(pH8.4),200mmol/L氯化钾(KC1),15mmol/L氯化镁(MgCl₂)。5.14分子量标记：100bp~3000bpDNAMarker。5.15酶切缓冲液：含10mmol/LTris-HCI(pH7.5),10mmol/LMgCl₂,50mmol/LNaCl,0.1mg/mL5.16RNaseA酶溶液：用高压灭菌的去离子水溶解RNaseA酶为10mg/mL的溶液，分装后于-20℃保存，避免反复冻融。5.17蛋白酶K溶液：用高压灭菌的去离子水溶解蛋白酶K为20mg/mL的溶液，分装后于-20℃保存，避免反复冻融。5.18乙酸钠溶液，3mol/L:在80mL水中，加入40.81g三水合乙酸钠，溶解后用冰乙酸调节pH值到5.2,用水定容到100mL,分装后高压灭菌。5.19Tris-HCI,1mol/L,pH8.0:在800mL去离子水中溶解121.1gTris,冷却至室温后用浓盐酸调节溶液的pH值至8.0,加水定容至1L,分装后高压灭菌。5.20EDTA,0.5mol/L,pH8.0:称取186.1gEDTA-Na₂·2H₂O,加入700mL水中，在磁力搅拌器上剧烈搅拌，用10mol/L氢氧化钠调pH值至8.0,用水定容到1L,分装后高压灭菌。5.21CTAB提取缓冲液I:在800mL去离子水中加入46.75g氯化钠，溶解后加入1mol/LTris-HC(pH8.0)50mL,0.5mol/LEDTA(pH8.0)20mL,在磁力搅拌器上剧烈搅拌，用10mol/L氢氧化钠调节溶液的pH值至8.0,用水定容至1L,分装后高压灭菌。5.22CTAB提取缓冲液Ⅱ:在800mL去离子水中加入46.75g氯化钠，20gCTAB,完全溶解后加入1mol/LTris-HCl(pH8.0)50mL,0.5mol/LEDTA(pH8.0)20mL,用水定容至1L,分装后高压灭5.23Tris饱和苯酚和三氯甲烷混合液，V(Tris饱和苯酚)+V(三氯甲烷)=1+1。5.24三氯甲烷和异戊醇混合液，V(三氯甲烷)+V(异戊醇)=24+1。5.25TE缓冲液(pH8.0):在800mL水中，依次加入10mL的1mol/LTris-HCI(pH8.0)和2mL5.26电泳缓冲液：Tris54g,硼酸27.5g,0.5mol/LEDTA溶液(pH8.0)20mL,加蒸馏水至1000mL;使用时10倍稀释。5.27溴化乙锭贮存液：用水配制成10mg/mL。5.28加样缓冲液：称取溴酚蓝250mg,加水10mL,在室温下过夜溶解；再称取二甲腈蓝250mg,用10mL水溶解；称取蔗糖50g,用30mL水溶解，合并三种溶液，用水定容至100mL,在4℃保存。6仪器和设备6.2生物安全柜。6.3离心机：转速≥12000r/min。6.4核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。6.5电泳仪。36.8高压灭菌器。μL于65℃预热的CTAB提取缓冲液IⅡ,混匀，65℃保温30min~90min,期间不时轻缓颠倒混匀；加入冷却至室温后加入5μLRNaseA溶液(10mg/mL),室温下放置30min;室温12000r/min离心10和三氯甲烷+异戊醇(24+1)抽提三次，12000r/min离心10min;将上清液转移至干净的2mL离心管液(预先加热至65℃有利于溶解DNA)中，-20℃保存备用。己烷，于磁力搅拌器上不断振荡混合2h后，加入25mLCTAB提取缓冲液IⅡ,继续于磁力搅拌器上振荡Tris饱和苯酚+三氯甲烷(1+1),轻缓颠倒混匀溶液；12000r/min离心10min,取上清液，加入与上清液等体积三氯甲烷+异戊醇(24+1),轻缓颠倒混匀，12000r/min离心2min至分层；将上清液转移至于100μLTE缓冲液(预先加热至65℃有利于溶解DNA)中，-20℃保存备用。47.4PCR检测7.4.1PCR反应体系10×PCR缓冲液dNTP溶液(10mmol/L)TaqDNA聚合酶(5U/μL)上游引物(10μmol/L)下游引物(10μmol/L)DNA模板(10ng/μL-50ng/μL)4℃保存。检测过程中设置PCR扩增空白对照、阴性对照和阳5如果PCR扩增产物电泳检测结果阳性，进行限制性内切酶酶切反应或进行测序(序列参考附录A)。酶切反应体系(20μL):StuI酶2U,酶切缓冲液2L,加入PCR扩增产物至总体积20μL。酶切在37℃下进行，20min。酶切完成后电泳，方法见7.4.3。8结果判断与表述8.1PCR扩增产物电泳检测结果阳性样品的PCR扩增产物大小为201bp(序列参考附录A)。8.2限制性内切酶酶切结果阳性样品PCR产物采用内切酶StuI酶切后，酶切片段大小为118bp和83bp。8.3结果表述PCR产物为阳性，限制性内切酶酶切产物片段大小正确，确认含有鸭源性成分，表述为检出鸭源性成分；酶切产物片段大小不正确，确认不含有鸭源性成分，表述为未检出鸭源性成分。PCR产物为阴性者判定不含有鸭源性成分，表述为未检出鸭源性成分。9检测过程中防止交叉污染的措施按照GB