DB51T 1298-2011 山羊传染性胸膜肺炎诊断技术规范　

备案号：30901-2011DB51/T1298—2011山羊传染性胸膜肺炎诊断技术规范四川省质量技术监督局发布IDB51/T1298—2011 12规范性引用文件 13术语与定义 14临床症状与剖检变化 15病原分离与鉴定 2附录A(资料性附录)培养基 6附录B(资料性附录)试剂配制 7本标准由四川省畜牧食品局提出并归口。本标准由四川省质量技术监督局批准发布。本标准起草单位：西南民族大学四川省畜禽繁殖改良总站。本标准主要起草人：杨发龙岳华王永汤承傅昌秀。11范围本标准规定了山羊传染性胸膜肺炎的病原分离培养及山羊支原体山羊肺炎亚种聚合酶链式反应检测的技术要求。本标准适用于山羊传染性胸膜肺炎的诊断，聚合酶链式反应适用于山羊支原体山羊肺炎亚种的检测与鉴定。下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。下列术语和定义适用于本标准。山羊传染性胸膜肺炎ContagiousCaprinePleuropneumonia是由山羊支原体山羊肺炎亚种感染山羊而引起的一种以呼吸道症状为主要特征的传染病。聚合酶链式反应polymerasecha是一种分子生物学技术，用于体外大量扩增特定的DNA片段。是人工合成的两段寡核苷酸序列，用于聚合酶链式反应，其中一条引物与目标片段一端的一条DNA模板链互补，另一条引物与目标片段另一端的另一条DNA模板链互补。4临床症状与剖检变化该病的典型临床症状表现为极度高热(41℃-43℃),随后2d-3d出现明显的呼吸道症状，表现为呼吸加速、显得痛苦、有时发现呼噜声，出现持续性的剧烈咳嗽。在疾病后期病羊不能运动、两前肢分开站立、脖子僵硬前伸，有时嘴里不断流出涎液。本病的病变多局限于胸腔内。多在一侧肺脏发生严重的浸润和明显的肝变，其肝变区凸出肺表面，颜色由红至灰不等。病肺质硬而没有弹性，切面呈大理石状。纤维蛋白渗出液充盈使肺小叶间组织变宽，2用无菌技术，采集肺组织(病健交界处最好)、胸腔渗出液及纵隔淋巴结。采集的病料在低温条件下尽快(24h内)送到实验室进行检测，如果检测不能及时进行，应保存在5.2.2.1鼻拭子3呈轻微混浊，无菌膜、无沉淀、无颗粒悬浮。在琼脂平板上生长迟缓，形成极小的水滴状圆形、透明菌落，需用放大镜或低倍显微镜进行观察。菌落中央有乳头状突起，呈“煎蛋状”。5.2.4.2染色镜检取液体培养物或固体培养基上菌落涂片，姬姆萨氏染色法染色，1000倍显微镜下观察。菌体多呈球5.3.1主要设备5.3.1.5微量高速离心机(适合于对PCR反应管进行离心操作)5.3.1.6高压灭菌锅5.3.1.7恒温水浴锅5.3.2主要试剂5.3.2.1引物(10μmol/L)5.3.2.2DNA提取试剂蛋白酶K、十二烷基硫酸钠(SDS)、酚、氯仿、异戊醇、无水乙醇。TaqDNA聚合酶(5U/μL)、MgCl₂(25mmol/L)、dNTP(每种浓度为2.5mmol/L)、10×PCRBuffer(无5.3.2.4STE缓冲液(组成及配制方法见附录B)5.3.2.7琼脂糖(电泳级)5.3.2.10水所用水应符合GB/T6682中三级水(三蒸水)规格。45.3.3DNA提取组织样本：肺等组织样本，按1g加入1mL的STE,进行研磨，3000r/min进行离心10min,取上清液，12000r/min进行离心20min,弃上清，沉淀用棉拭子：将鼻腔拭子等棉拭子浸入1mL的STE缓冲液中30min,反复挤压，然后以12000r/min离心20min,弃去上清，收集沉淀用于DNA提取。液体培养物：12000r/min离心20min,弃上清，收集沉淀用于DNA提取。5.3.3.2DNA提取方法混匀，在56℃水浴60min。加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(25:24:1),混匀，12000r/min离心5min。转移上清到另一离心管中，加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1),颠倒混匀，12000r/min离心5min。取上清，加入2.5倍体积的预冷无水乙醇，-20℃沉淀30min,12000r/min离心5min,弃去上清液。用1mL70%℃保存备用。5.3.4PCR扩增每次对检测样品进行PCR扩增时，均需要设置阳性和空白对照。PCR反应条件为95℃预变性5min,然后进行95℃1min,48℃1min,72℃30s的循环，进行35个循环，最后72℃延伸10min,4℃保存。5.3.5PCR产物的电泳检测用TAE电泳缓冲液配制成2%琼脂糖凝胶(见附录B)。取5μLPCR产物与1μL6×上样缓冲液混合，分别加入样品孔，同时在一加样孔中加入DNA分子量标准，以5V/cm恒压电泳，采用凝胶成像系统进行拍照。阳性对照出现一条316bp左右大小的条带，且无模板空白对照不出现条带，见图1。在满足上述条件的情况下，被检样品的PCR产物经电泳后出现一条316bp左右的条带判定为阳性(+);被检样品的PCR产物经电泳后不出现316bp左右的条带判定为阴性(一)。5DB51/T1298—2011400bp200bpM——DNA分子量标准；P——阳性对照；N——阴性对照。6(资料性附录)A.1改良Thiaucourt's培养基A.1.1组成PPLO肉汤650mL;健康马血清250mL;25%酵母浸出液100mL;50%葡萄糖溶液4mL;25%丙酮酸钠溶液8mL;1%醋酸铊溶液25mL;青霉素20万单位；0.4%酚红溶液5mL;A.1.2制备方法制备时，将PPLO肉汤进行121℃30min高压蒸汽灭菌，其他成分滤过除菌，待PPLO肉汤降温至55℃-60℃时，其他成分与其混合，用灭菌的1mol/L氢氧化钠溶液调节pH至7.6-7.8.制备固体培养基时，在PPLO肉汤中加入培养基总体积1.5%的琼脂，加热溶解后121℃30min高压蒸汽灭菌，待温度降至55℃-60℃时与其他成分混合，固体培养基中不含酚红。7(资料性附录)试剂配制B.1STE缓冲液0.1mol/LNaC110mmol/LTris.HC1(pH8.0)1mmol/LEDTA(pH8.0)B.2TAE电泳缓冲液(pH8.0)50×TAE电泳缓冲液贮存液：Tris碱242gEDTA37.