19临床病原学实验诊断

临床病原学实验诊断杨宇丹吉林大学中日联谊医院重点掌握细菌耐药性、机制及意义1常见细菌感染的检测方法2结核杆菌感染的免疫学方法3艾滋病病原学检测方法4乙肝病毒检测方法及临床意义5TORCH检测方法及临床意义6第二节标本采集和运送标本采集和运送的基本原则

•根据病史与临床表现确定标本采集的类型与部位，尽量采集病变明显部位标本。•在发病的早期或急性期采集标本，最好在抗生素使用前采集。•采集标本防止污染，并置于无菌容器，加盖密封、立即送检。•标本必须贴上标签，与检验申请单同时送检。•烈性传染病标本需专人护送。血液标本严格无菌条件下采静脉血，成人10～20ml，婴儿和儿童3～5ml。原则上应在应用抗菌药物前采血，但对于已经应用抗菌药物治疗者，则必须在下次用药前采血。疑为菌血症、败血症和脓毒血症患者，一般在发热高峰前0.5-1小时或发热后1小时采血。由于大多数菌血症呈周期性，故血标本也需在24h内周期性收集2～3次分别培养。35-37

C进行培养，培养瓶不要冷藏或冷冻。革兰氏阳性菌革兰氏阴性菌金黄色葡萄球菌脑膜炎奈瑟菌表皮葡萄球菌卡他莫拉菌A群、B群链球菌伤寒及副伤寒沙门氏菌草绿色链球菌大肠埃希菌肺炎链球菌肺炎克雷伯菌肠球菌肠杆菌属菌种厌氧链球菌沙雷氏菌产单核李斯特菌铜绿假单胞菌产气荚膜梭菌假单胞菌属菌种丙酸杆菌不动杆菌念珠菌流感嗜血杆菌

胎儿弯曲菌

拟杆菌

梭杆菌血培养中常见的致病菌脑脊液与其他穿刺液脑脊液一般由腰穿取得，首先将脑脊液注入到培养瓶中，其余分别收集于小试管中，每管1-2ml，做化学检查、免疫学检查、一般性状检查和显微镜检查。采集的脑脊液标本应立即保温送检（或床边接种），一般不能超过1小时。培养方法：将脑脊液1000转离心10分钟，取沉渣进行培养，5%CO2环境、35

C培养3天。胸水、腹水、心包液、关节液、鞘膜液等标本由临床医师行穿刺术抽取。胸水、腹水和心包液等因标本含菌量少宜采集较大量标本送检以保证检出率。立即送检。急性细菌性脑膜炎急性非细菌性脑膜炎慢性脑膜炎肺炎链球菌新生隐球菌结核杆菌流感嗜血杆菌念珠菌新生隐球菌脑膜炎奈瑟菌病毒念珠菌无乳链球菌弓形虫奴卡氏菌革兰氏阴性杆菌

放线菌产单核李斯特菌

沙门氏菌结核杆菌

梅毒螺旋体引起脑膜炎的病原体尿液

常用清洁中段尿作为送检标本。采集时应注意无菌操作，清洗、消毒尿道口。宜取晨尿。标本宜在应用抗菌药物之前或停用抗菌药5天后采集。对于厌氧菌的培养，采用膀胱穿刺法收集，无菌厌氧小瓶运送。粪便主要采集含脓、血或粘液粪便。培养菌种包括沙门氏菌、志贺氏菌、霍乱弧菌及副溶血弧菌等；在无法获得粪便的情况下，可用直肠拭子采集。根据细菌种类不同选用合适的培养液以提高阳性检出率。一次粪便培养阴性不能完全排除胃肠道病原菌的存在，传染性腹泻患者需三次送检进行培养。革兰氏阳性菌革兰氏阴性菌金黄色葡萄球菌伤寒及其他沙门氏菌厌氧链球菌志贺氏菌结核分枝杆菌致病大肠埃希菌产气荚膜梭菌弧菌属菌种难辨梭状芽孢杆菌产气单胞菌属白色念珠菌邻单胞菌

弯曲菌

小肠结肠炎耶尔森氏菌粪便标本中常见的病原菌呼吸道标本主要包括鼻咽拭子、鼻咽洗液、深部痰以及通过气管收集的标本等。留痰前应先漱口清洁口腔，然后咳出气管深处的痰及时送检。标本的采集应根据痰液检查目的不同而异。一般检查应取清晨第一口痰，盛于清洁容器内送检，作细菌培养需用无菌容器留取，浓缩法找抗酸杆菌应留24小时痰。合格的痰标本（鳞状上皮细胞≤10个/低倍镜视野，≥25个白细胞/低倍镜视野）富含上呼吸道正常菌群，在病原学诊断时需加以注意。泌尿生殖道标本根据不同疾病的特征及检验目的采集不同标本。性传播疾病常取尿道口分泌物、外阴糜烂面病灶边缘分泌物、阴道宫颈口分泌物和前列腺液等。生殖道疱疹常穿刺疱疹液。盆腔脓肿则于直肠子宫陷凹处穿刺脓液。淋病奈瑟菌需保温送检。创伤、组织和脓肿标本首先清创，防止表面污染菌混入影响检测结果。开放性脓肿用无菌棉拭子取脓液及病灶深部分泌物。封闭性脓肿，用无菌注射器穿刺抽取。疑为厌氧菌，取脓液后立即排净注射器内空气，针头插入无菌橡皮塞送检，否则标本接触空气导致厌氧菌死亡而降低临床分离率。组织标本不可用福尔马林固定，活体组织采取的微量标本，可直接接种在培养基内。革兰氏阳性菌革兰氏阴性菌葡萄球菌链球菌消化链球菌碳疽芽孢杆菌破伤风芽孢杆菌产气荚膜梭菌溃疡棒状杆菌结核分枝杆菌放线菌奴卡菌念珠菌肠杆菌科菌假单胞菌拟杆菌梭杆菌嗜血杆菌产碱杆菌无色杆菌弧菌科细菌产气单胞菌脓汁及创伤分泌物中常见的病原菌第三节细菌病原学检查采集标本直接涂片、染色镜检需氧培养观察菌落形态细菌形态、染色性生化鉴定血清学鉴定药敏试验确定致病菌增菌培养分离培养厌氧培养二氧化碳培养一、细菌感染的微生物检查临床细菌学检测流程细菌病原学检查的常用检测手段直接镜检分离培养鉴定抗原抗体检测细菌毒素检测核酸检测1.显微镜检测染色标本的显微镜检测不染色标本的显微镜检测(1)结果对病原学诊断具有一定意义，尤其对无菌体液的直接镜检更具有诊断价值。(2)腔道分泌物涂片镜检对进一步检出的步骤、采用的方法和选用的培养基有重要提示作用。(3)革兰染色*：用于渗出液、尿液、脑脊液的细菌检查

抗酸染色：用于分枝杆菌检查

(1)包括湿片悬滴法检测和湿片细菌计数(2)借助暗视野显微镜或相差显微镜观察标本中病原菌的生长和运动方式，有助于病原体诊断。当米泔水样便中见有鱼群状运动活泼的弧菌，常提示为霍乱弧菌感染，可进一步用碱性蛋白胨水增菌，分离接种于TCBS选择培养基。革兰氏阴性杆菌革兰氏阳性球菌抗酸染色2.分离培养与鉴定*选择合适的培养基革兰阳性球菌和革兰阳性杆菌：血琼脂培养基革兰阴性杆菌，如肠杆菌科细菌：肠道选择鉴别培养基（伊红亚甲蓝培养基）革兰阴性球菌：Thayer-Martin培养基厌氧菌:厌氧培养基提供合适的气体、温度和pH值气体条件：大气、厌氧、微需氧温度：35℃pH值：7.2-7.6

鉴定：菌落性状细菌的形态和染色细菌生化反应结果和血清学试验临床意义：

分离、培养和鉴定是细菌感染性疾病诊断的“金标准”3.病原体核酸检测*采用PCR技术，适用于：（1）目前尚不能分离培养、很难分离培养的微生物检测，例如麻风杆菌、幽门螺杆菌、嗜肺军团菌。易出现假阴性和假阳性结果。（2）生长缓慢的细菌，如结核分枝杆菌属细菌。（3）多种细菌混合感染的诊断。4.抗原抗体检测病原体抗原检测〔临床意义〕在无菌体液、血液等标本中，阳性结果有诊断价值，提示某种感染性病原体的存在。病原体抗体检测〔临床意义〕

特异性试验对细菌感染性疾病的诊断有一定的价值，但不能等同于病原体检出，更适于流行病学调查和回顾性分析或慢性细菌性感染。5.细菌毒素检测（1）外毒素检测使用生物学、免疫学、分子生物学等方法检测自动化检测法：如利用免疫磁性电化学发光传感器检测葡萄球菌肠毒素、肉毒毒素、霍乱肠毒素。（2）内毒素检测鲎实验：革兰阴性菌脂多糖（LPS）最敏感检测方法有利于判定细菌感染严重程度，及早预防和发现内毒素休克的发生。药敏结果的分析耐药菌检测试验抗微生物药物敏感性试验耐药机制重要的耐药菌二、细菌耐药性检查*

（一）耐药菌株

AntibioticResistanceAGlobalProblem1961—MRS耐甲氧西林葡萄球菌1967—PRSP耐青霉素肺炎球菌1983—ESBLS质粒介导的产超广谱β内酰胺酶大肠埃希菌1986—VRE耐万古霉素肠球菌1997—VISA万古霉素中度耐药金黄色葡萄球菌2002—VRSA耐万古霉素金黄色葡萄球菌

（二）耐药机制*1.遗传学机制染色体介导的耐药：为细菌本身所固有的耐药，一般具有种属特异性,如肠球菌耐头孢菌素，革兰阴性杆菌耐万古霉素等。质粒介导的耐药：耐药基因易于传播,目前该类耐药在临床上占有重要地位。如由质粒介导的产超广谱β-内酰胺酶（ESBL）的大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌。2.生物化学机制产生灭活酶或钝化酶使抗生素失活。如β-内酰胺酶、氨基糖苷类钝化酶、氯霉素乙酰基转移酶。作用靶位的改变使抗生素失去作用位点。如MRSA产生青霉素结合蛋白2a。主动外排机制。如铜绿假单胞菌其外膜存在着独特的药物泵出系统。细菌生物膜的形成。代谢拮抗剂产生或代谢旁路产生。1.抗菌药物敏感性试验

（antimicrobialsusceptibilitytest，AST）药敏试验，是指在体外测定抗菌药物抑制或杀灭细菌的能力，即是测定细菌对抗菌药物的敏感性。药敏试验用抗菌药物的分组*CLSI（临床实验室标准化协会）将抗菌试验药物分成四组A组（临床常规首选药物）B组（临床主要使用药物）C组（对不常见临床分离细菌使用药物）U组（仅用于泌尿道中分离细菌的药物）（三）细菌耐药检测项目临床药敏试验的推荐试用药物常用药敏试验的方法体外AST包括：抑菌试验：稀释法

纸片扩散法

E-test杀菌试验联合药敏试验（1）稀释法稀释法包括两种：肉汤稀释法和琼脂稀释法。基本原理：在肉汤或琼脂中将抗菌药物进行一系列（对倍）稀释后，定量接种待检菌，35℃孵育24h，待检菌肉眼未见生长的最小药物浓度，即为该药物对待检菌的最低抑菌浓度MIC。试验菌的结果报告可用MIC(μg/ml)数值或用敏感(S)、中介(I)和耐药(R)报告。MIC测定是药敏试验的金标准方法。（2）纸片扩散法（K-B法）是操作最简易、使用最广泛的抗菌药物敏感性试验。将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼脂平板上。纸片中所含的药物吸收琼脂中的水分溶解后不断向纸片周围区域扩散形成递减的梯度浓度。在纸片周围抑菌浓度范围内测试菌的生长被抑制，从而形成透明的抑菌圈。抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度，并与该药对测试菌的最低抑菌浓度(MIC)呈负相关，即抑菌圈越大，MIC越小。根据CLSI标准，对量取的抑菌圈直径判断病原菌对该药物的敏感/中介/耐药。由于培养基质量，药敏纸片质量、接种菌量、试验操作质量、孵育条件，抑菌圈测量工具等因素都能影响纸片扩散法的结果，所以必须定期以标准菌株做质量控制。纸片扩散法操作简易，结果直观易于理解，但非定量结果，且对慢生长菌和扩散慢的药物纸片法不适用。（3）浓度梯度纸条扩散法（Etest）是一结合稀释法和扩散法原理对细菌药敏试验直接定量的技术。将E试条放在细菌接种过的琼脂平板上，经孵育过夜，围绕试条明显可见椭圆形抑菌圈，圈的边缘与试条横向相交处的读书刻度即为MIC，采用CLSl标准判别敏感、中介或耐药。1.常见菌试验结果；2.苛养菌试验结果；3.厌氧菌试验结果；4.酵母菌试验结果；5.真菌试验结果。（4）联合药敏试验此实验是为了解两种抗菌药物联合应用时的抗菌效果。联合药敏试验的结果可以表现为无关、拮抗、累加、协同。协同作用是临床和实验室期盼的结果。协同用药最典型的例子是青霉素或其同类物与氨基糖苷类抗生素联合治疗肠球菌感染心内膜炎。抗菌药物联合应用目的在于：①混合性感染时，单一用药可能不能控制各种病原体；②预防或推迟细菌抗生素耐药性的发生；③联合用药比单一用药时毒性小；④联合用药比单一用药时效果更好。（5）最低杀菌浓度测定（MBC）：是指能杀灭99.9％以上测试菌量的最低药物浓度。当某个抗菌药物的MBC/MIC≦4时，该抗菌药通常被认为是杀菌剂。（6）血清抗菌药物浓度测定：是取患者血液分离的血清对感染部位分离确证的病原菌的抑菌或杀菌能力测定。提供临床现用抗菌药物的疗效考核评价及感染预后判断的实验数据。结果的判断以肉眼可见生长细菌的血清最高稀释度为血清的抑菌力，菌落计数≤0.1%最初接种菌量的血清最高稀释度为血清杀菌力。

血清抑菌力：血清杀菌力>1：8提示治疗方案有效。2.耐药菌检测试验*（1）直接β内酰胺酶试验：用于检测β内酰胺酶细菌耐药，比常规药敏试验可提前24-48h获得结果。目前多采用色原法，以头孢硝噻吩为底物，直接与试验菌作用，纸片由黄色变为红色为阳性。检测阳性结果表明：该细菌对所有对青霉素酶不稳定的青霉素（包括青霉素和广谱青霉素）耐药。需要对葡萄球菌、肠球菌、流感嗜血杆菌、淋病奈瑟菌、卡拉莫拉菌等常规检测。（2）超广谱β内酰胺酶的检测（ESBLs）ESBLs由革兰氏阴性杆菌产生，质粒编码，其活性可被克拉维酸抑制，可通过转化、转导、接合、转移等方式传递，易于造成耐药菌流行。检测包括纸片法筛查和确证试验。产ESBLs的克雷伯菌属、大肠埃希菌和奇异变形杆菌应报告对所有青霉素类、头孢菌素类（包括头孢吡肟）以及氨曲南耐药，但不包括头霉素、碳青霉烯类和含β-内酰胺酶抑制剂的复合制剂。肠杆菌科细菌ESBLs的检测（3）MRS筛选：常用纸片扩散法、稀释法、琼脂筛选法MRS多是MecA基因编码了对β-内酰胺类药物低亲和力的蛋白PBP2a，取代了固有的青霉素结合蛋白PBPs。MRS的简便检测方法是用头孢西丁纸片扩散法，要基于头孢西丁的结果报告苯唑西林敏感或耐药。绝大多数的MRS具有多重耐药性，包括氨基糖苷类、大环内脂类、四环素类。临床治疗MRS引起的感染首选万古霉素。葡萄球菌mec-A介导的耐药性检测（4）耐青霉素肺炎链球菌检测试验常用纸片扩散法作为过筛实验，再用稀释法或E试验做确定试验。纸片扩散法的抑菌圈直径OX<19mm时，提示细菌对青霉素耐药或中度敏感再做MIC测定，MIC≧2ug/ml为耐药。以ATCC29212和ATCC51299为质控菌株。（5）高水平氨基糖苷类耐药的肠球菌（HLAR）采用纸片扩散法和肉汤稀释法。庆大霉素纸片扩散法的抑菌圈直径≤6mm时，或MIC>500μg/ml，判断为耐药。当抑菌圈直径在7-9mm，可进一步采用肉汤稀释法或琼脂稀释法测定MIC以明确是否耐药。以ATCC29212和ATCC51299为质控菌株。3.药敏试验结果的表示及其临床意义敏感(susceptible,S)：表明该菌株所致感染可使用此种抗微生物药物常规剂量进行治疗，除非存在禁忌证。耐药(resistant,R)：耐药是指即使使用大剂量的抗菌药物治疗时，该抗菌药在感染部位也不能抑制该感染菌生长。中介(intermediate,I)：①抗菌药对感染菌的最低抑菌浓度MIC接近该药在血液和组织中通常可达到的浓度，感染菌的临床应答率可能低于敏感菌。②意味着某些药物在生理浓集的部位(如尿液中的喹诺酮类和β内酰胺类)具有临床效力，或者可用。③若某药在高剂量使用时是安全的(如β内酰胺类)，则中介意味着高于通常剂量的药物进行治疗可能有效。④中介还意味它是一个缓冲区，避免微小的、未能控制的技术因素造成重大的结果解释错误，特别是对那些药物毒性范围窄的药物。呼吸系统感染的病原学诊断策略诊断疾病的步骤收集资料病史体格检查辅助检查验证或修正诊断分析综合资料初步诊断进一步的必要检查

采集标本直接涂片、染色镜检需氧培养观察菌落形态细菌形态、染色性生化鉴定血清学鉴定药敏试验确定致病菌增菌培养分离培养厌氧培养二氧化碳培养痰涂片、痰培养或血培养阳性结果，明确致病菌阴性结果胸腔积液穿刺胸水常规、生化、涂片、培养明确致病菌无胸腔积液纤维支气管镜阴性结果纤维支气管镜涂片、培养等明确致病菌阴性结果肺组织活检病例分析患者×××，男性，32岁。三天前受凉后出现咽痛、咳嗽、咳痰，为少量白色黏痰。有发热，体温最高可达40.2℃，持续发热，伴寒战、头痛、肌肉酸痛、关节痛。在社区给予青霉素治疗无好转。昨日，上述症状加重，咳出铁锈色痰，出现胸痛。既往体健，无结核病及结核病接触史。体检：T39.2℃，P92次/min，R35次/min，BP130/70mmHg。急性病容，神智清楚，呼吸急促，口周疱疹，口唇无发绀。咽部充血，扁桃体Ⅱ°肿大。胸廓对称，呼吸促，左侧呼吸运动减弱，语颤增强。左下肺叩诊浊音，呼吸音减弱，可闻及细湿罗音。辅助检查：血白细胞21.3×109/L，中性粒细胞0.87；C反应蛋白132mg/L；血沉91mm/1h。痰涂片查到革兰阳性双球菌。胸部X光片示左下肺斑片状阴影。思考题1、本病例的初步诊断是什么？2、诊断依据有哪些？3、进一步检查项目有哪些？4、如何确定病原体？肺炎(pneumonia)是指病原菌入侵肺部而引起的感染性疾病。大叶性肺炎是临床上最常见的肺炎之一，多种细菌均可引起大叶性肺炎，但大多数为肺炎链球菌。少数为肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌、流感嗜血杆菌等。肺炎链球菌为口腔及鼻咽部的正常寄生菌群，若呼吸道的排菌自净功能及机体的抵抗力正常时，不引发肺炎。当机体受寒、过度疲劳、醉酒、感冒、全麻等使呼吸道防御功能被削弱，细菌侵入肺泡通过变态反应使肺泡壁毛细血管通透性增强，浆液及纤维素渗出，富含蛋白的渗出物中细菌迅速繁殖，并通过肺泡间孔或呼吸细支气管向邻近肺组织蔓延，波及一个肺段或整个肺叶。好发于青壮年男性和冬春季节。常见诱因有受寒、淋雨、醉酒等。主要病理改变为肺泡的渗出性炎症和实变。临床症状有突然寒战、高热、咳嗽、胸痛、咳铁锈色痰。血白细胞计数增高；典型的X线表现为肺段、叶实变。病程短，及时应用青霉素等抗生素治疗可获痊愈。鉴别诊断

(1)干酪性肺炎*

(2)肺癌伴发阻塞性肺炎

(3)急性肺脓肿：大量脓臭痰，X线检查有液平面的空洞

(4)肺炎链球菌肺炎与其它病菌引起的肺炎的鉴别诊断①革兰阴性杆菌肺炎②金葡菌肺炎：X线阴影在短期内易变、多变是重要特征③肺炎支原体肺炎：阵发性刺激性咳嗽可为其突出症状。目前常用的获取标本的方法有：1、痰：痰培养结果要结合痰涂片。107cfu／ml

2、经纤维支气管镜或人工气道吸引：105cfu／ml3、防污染样本毛刷(PSB)：103cfu／ml4、支气管肺泡灌洗(BAL)：104cfu／ml

5、经皮细针抽吸(PFNA)临床一般用于对抗生素经验性治疗无效或其他检查不能确定者。6、血和胸腔积液培养

明确病原学诊断有助于临床治疗，尤其对于医院获得性肺炎。但是，病原学诊断的阳性率和特异性不高，而且培养结果滞后，不利于指导早期的抗菌药物治疗。第四节细菌感染免疫检测*(一)血清抗链球菌溶血素“O”试验——抗“O”

溶血素“O”是一种A群溶血性链球菌的毒素(streptolysin)，属蛋白质，能溶解RBC，杀伤WBC，和血小板，它具有抗原性，可使机体产生抗体——抗链球菌溶血素“

O”(anti-streptolysin“O”,抗“O”或ASO)。机体受A群溶血性链球菌感染的2－3周，血清中即出现抗“O”，该抗体滴度直至病愈后数月至半年才降至正常水平。[参考值]乳胶凝集法（LAT）：阴性（<500U）[临床意义]ASO滴度升高，表示近期有A群溶血性链球菌感染。

1．常见于活动期风湿热，风湿性关节炎。

2．急性肾小球肾炎、急性上呼吸道感染；

3．皮肤或软组织感染等。〔二〕伤寒和副伤寒沙门氏菌免疫测定伤寒沙门菌有菌体(O)抗原，鞭毛(H)抗原和表面(Vi)抗原，副伤寒沙门菌甲、乙、丙的鞭毛H抗原分别为A、B、C抗原。*

1、肥达氏反应（Widalreaction,WR）

WR是利用伤寒和副伤寒沙门氏菌菌液为抗原，检测病人血清中有无相应抗体的一种凝集试验。[参考值]直接凝集法伤寒WR：抗体效价H<1：160；O<1：80。副伤寒WR：抗体效价A、B、C三型分别<1：80[临床意义]WR阳性一般出现在伤寒发病后一周，阳性率为10％，第二周上升为60％～70％，第四周可达90％。单份血清抗体效价大于参考值有诊断意义。动态观察WR持续超过参考值或较原效价升高4倍以上更有价值。接种伤寒菌苗或以往患过寒伤者，血清中可出现阳性反应，其抗体效价比参考值偏高。

早期应用抗生素及免疫抑制剂治疗者有10%可出现阴性反应。[结果分析模式]O升高，H正常：伤寒发病早期或其他沙门菌感染的交叉反应。O正常，H升高：不久前曾患过伤寒或伤寒疫苗接种后，或非特异性回忆反应。O升高，H升高：伤寒可能性大。O升高，A、B、C任何一项升高：可能分别为副伤寒甲、乙、丙。2、伤寒和副伤寒沙门氏菌抗体IgM测定

[参考值]ELISA法：正常人为阴性或滴度<1：20

[临床意义]：IgM抗体于发病后一周即出现升高，有早期诊断价值，若其滴度>1：20对诊断伤寒携带者有意义；其敏感性和特异性优于肥达氏反应。3、伤寒和副伤寒沙门氏菌可溶性抗原测定伤寒沙门氏菌在体内繁殖、破裂，患者血及尿内可出现伤寒沙门氏菌抗原，用相应抗血清致敏胶乳，与患者血及尿中伤寒沙门氏菌可溶性抗原反应，可产生凝集。

[参考值]胶乳凝集试验法为阴性。

[临床意义]阳性对确诊伤寒沙门氏菌感染更有意义。（三）结核分支杆菌抗体和DNA检测机体在感染结核分支杆菌TB后，体内可产生特异性抗体(tuberculebacillusantibody,TB-Ab)，检测抗体可协助诊断。结核分支杆菌的DNA可通过PCR检测。

结核分枝杆菌感染检测免疫学方法：1.结核菌素试验

包括针对旧结核菌素OT与结核菌素纯蛋白衍生物PPD两种菌体蛋白，将蛋白注入皮内。感染结核杆菌：形成迟发性超敏反应性炎症。未感染结合杆菌：无反应。2.分枝杆菌抗体检测

[参考值]胶体金或ELISA法：TB-Ab为阴性，

[临床意义]

抗体阳性表示有TB感染，其阳性率为80～90％，其灵敏度>90%，特异性>85%；3.全血干扰素测定

当全血与PPD和对照抗原共同孵育后，致敏的淋巴细胞分泌IFN-γ，通过检测IFN-γ的含量鉴定菌种。4.PCR法检测TBDNA[参考值]TBDNA为阴性。

[临床意义]PCR检测DNA特异性更强，灵敏度更高，应注意防止污染及假阳性。(四)流行性脑脊髓膜炎免疫测定

流行性脑脊髓膜炎(epidemiccerebrospinalmeningitis)是由脑膜炎双球菌(meningococcus)感染所致。

[参考值]1、抗体测定：间接血凝试验和ELISA法，阴性；2、抗原测定：对流免疫电泳法、胶乳凝集试验法、RIA和ELISA法，均为阴性。

[临床意义]感染一周后抗体逐渐增高，2个月后逐渐下降；

疫苗接种者高抗体效价可持续一年以上。（五）幽门螺杆菌抗体检测

检测方法：斑点反应板上的固相胃幽门螺杆菌的混合抗原与血清中幽门螺杆菌抗体(helicobacterpyloriantibody,Hp-Ab)形成复合物，胶体金标记抗人IgG抗体再与复合物结合，形成肉眼可见的红色圆斑点。

[参考值]金标免疫斑点法为阴性（反应孔中只出现红色横线）。

[临床意义]Hp-Ab阳性见于胃、十二指肠Hp感染，其敏感性>90％，特异性>85％。（六）淋球菌血清学测定及DNA测定

用淋病奈瑟菌的特异性抗血清或单克隆抗体可直接检测临床标本（泌尿道和宫颈拭子）中的淋病奈瑟菌抗原，确定淋病奈瑟菌的存在。目前主要有ELISA、葡萄球菌A蛋白协同凝集试验等。

[参考值]淋病奈瑟菌抗原和抗体检查均为阴性；PCR检查DNA阴性。

[临床意义]淋球菌抗原检测，是较好的直接过筛试验、操作简单、不需活菌，可在应用抗生素、标本需长时间运送或细菌死亡时使用。抗体检查阳性率不高，诊断价值不大。PCR可早期快速诊断，但应避免污染。第五节病毒病原学检测人类获得性免疫缺陷病毒抗体及RNA检测

人类获得性免疫缺陷病毒(HIV)是艾滋病的病原体，是一种反转录病毒，基因为单链RNA。感染HIV数周到半年后，出现抗HIV抗体。抗体检测是艾滋病病原检测中常用方法。筛查试验采用ELISA法，确认试验采用免疫印迹WB。[参考值]筛查实验和确诊试验均阴性RT-PCR检查HIV-RNA为阴性。[临床意义]1.筛查试验：敏感性高，特异性低，存在假阳性可能。2.确认试验：阳性才能确定HIV感染，是必检项目。3.核酸检测：HIV感染辅助诊断。抗体筛查试验及确认试验结果未确定或低丙种球蛋白血症时具有重要意义。肝炎病毒主要有7型：甲型肝炎病毒（HAV）、乙型肝炎病毒（HBV）、丙型肝炎病毒（HCV）、丁型肝炎病毒（HDV）、戊型肝炎病毒（HEV）、庚型肝炎病毒（HGV）、输血传播病毒(TTV)，分别引起甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、丁型肝炎和戊型肝炎、庚型肝炎和输血传播病毒肝炎，这七种病毒分别属于不同的病毒科，生物学特征也显著不同，但共同的特点是均引起病毒性肝炎。病毒性肝炎血清标志物的检测一、甲型肝炎病毒标志物检测(hepatitisAvirus,HAV)(一)生物学性状：RNA(二)传染源和传播途径：粪口*(三)HAV的致病机制HAV感染所引起的组织病理损伤与下列因素有关：1、在感染早期，自然杀伤细胞（NK）对感染的肝细胞进行攻击；2、继之，特异性的T淋巴细胞被激活，在HLA介导下特异性CD8＋细胞直接发挥作用，使感染病毒的肝细胞发生膜穿孔，穿孔后的细胞由于细胞内外钠钾离子平衡的破坏造成各种代谢紊乱，最终细胞变性、肿胀、溶解和坏死；3、正常情况下，肝细胞表面表达的HLA水平不高，当淋巴细胞被激活后，可产生干扰素，它能促进HLA的表达，这种表达使T淋巴细胞对感染肝细胞的作用加强，同时还可抑制病毒的复制，限制病毒在肝脏组织中的扩散；1.甲型肝炎病毒抗原和RNA测定[参考值]：HAVAg:ELISA法，阴性；

HAV-RNA：RT-PCR法，阴性；[临床意义]：（1）HAVAg阳性：见于70.6%~87.5%的甲肝患者；HAVAg于发病前二周可从粪便中排出，其发病第一周粪便的阳性率为42.9%，1-2周为18.3%，2周后消失；（2）HAV-RNA阳性，对诊断具有特异性，特别是对早期的诊断意义更大。(四)甲型肝炎病毒标志物检测2.甲型肝炎病毒抗体的检测[参考值]ELISA法：抗HAV-IgM和抗HAV-IgA均为阴性；

抗HAV-IgG见于大部分成年人。[临床意义]（1）抗HAV-IgM阳性抗HAV-IgM是感染后早期抗体，感染1周后就能产生，HAV感染急性期迅速升高，平均持续达5个月，甲肝患者抗HAV-IgM阳性率在发病后2周为100%，1个月为76.5%，3个月为23.5%，6个月为5.9%，因此，抗HAV-IgM阳性说明机体正在感染HAV，它是早期诊断甲肝的特异性指标；

（2）抗HAV-IgA阳性甲肝早期和急性期，可在粪便中测得抗HAV-IgA呈阳性反应，是早期诊断甲肝的指标之一。（3）抗HAV-IgG阳性出现稍晚，感染HAV3周后可在血清中检出，2-5个月后达高峰，以后有所下降，几乎终身存在，是一种保护性抗体。

高滴度的抗HAV-IgG对诊断感染有参考和辅助诊断价值，是感染过HAV的指标，提示继往感染，可做为流行病学调查的指标。（一）生物学性状：RNA（二）传播：血液传播*（三）丙型肝炎病毒标志物检测

1、丙型肝炎病毒RNA检测[参考值]斑点杂交试验和PCR为阴性。[临床意义]丙型肝炎病毒RNA（HCV-RNA）阳性表明HCV复制活跃，传染性强；HCV-RNA转阴提示HCV复制受抑，预后较好。连续观察HCV-RNA，结合抗-HCV的动态变化，可作为丙型肝炎预后判断和干扰素等药物疗效的评价指标。二、丙型肝炎病毒标志物检测(hepatitisCvirus,HCV)

2、丙型肝炎病毒抗体IgM测定

[参考值]ELISA或RIA法均为阴性；

[临床意义]

（1）早期诊断指标：丙型肝炎患者发病后4周丙型肝炎病毒抗体IgM（抗-HCVIgM）即可阳性，持续1-4周。（2）6个月内痊愈者，抗-HCVIgM转阴，反之将转为慢性丙型肝炎。3、丙型肝炎病毒IgG抗体测定

[参考值]ELISA或RIA法均为阴性；

[临床意义]（1）血液中抗-HCVIgG阳性，表示已被HCV感染，不可献血。（2）判定病情经常接受血制品治疗的患者可以合并HCV的感染，易使病变转为慢性、肝硬化或肝癌。（3）非早期诊断指标。生物学性状：RNA*(一)丁型肝炎病毒抗原的测定

[参考值]IFA、RIA法和ELISA法均为阴性

[临床意义]丁型肝炎病毒抗原（HDVAg）出现较早，但仅持续1-2周，由于检测不及时，往往呈阴性反应。HDVAg和HBsAg同时阳性，表示丁型和乙型肝炎病毒同时感染，患者可迅速发展为慢性或急性重症肝炎。三、丁型肝炎病毒标志物检测(hepatitisDvirus,HDV)(二)丁型肝炎病毒抗体的测定丁型肝炎病毒抗体分为抗-HDVIgG和抗-HDVIgM两型。[参考值]IFA、RIA法和ELISA法均为阴性。[临床意义]1、抗-HDVIgG阳性：只能在HBsAg阳性血清中检测到，是诊断丁型肝炎的可靠指标，即使HDV感染终止后仍可保持多年。

2、抗-HDVIgM阳性：丁型肝炎早期诊断。(三)丁型肝炎病毒RNA测定[参考值]RT-PCR的方法为阴性。[临床意义]

明确诊断生物学形状：RNA病毒，感染为自限性，一般无慢性化过程，也无慢性HEV携带者。经胃肠传播。(一)戊型肝炎病毒抗体测定

[参考值]IFA、RIA法和ELISA法均为阴性。

[临床意义]抗-HEVIgM阳性：目前临床上诊断常用检测抗-HEVIgM的方法，确诊患者受HEV感染，在95%的急性期病人抗-HEVIgM呈阳性反应。抗-HEVIgG阳性：如血清中存在抗-HEVIgG，则不能肯定是否过去曾受过HEV感染。对于抗-HEVIgG持续存在的时间，尚不清楚。病情进展：凡戊型肝炎恢复期出现抗-HEVIgG效价超过或等于急性期的4倍，提示HEV新近感染，有临床诊断意义。四、戊型肝炎病毒标志物检测(hepatitisEvirus,HEV)(二)戊型肝炎病毒RNA测定[参考值]RT-PCR为阴性[临床意义]1)HEV感染的早期诊断；2)对抗体检测结果进行确证；3)判断病人排毒期限；4)分子流行病学研究。(一)庚型肝炎病毒抗体测定

[参考值]RIA和ELISA均阴性

[临床意义]抗体阳性表示曾感染过HGV，多见于输血后肝炎或使用血液制品引起的HGV合并HCV感染的患者，但是，目前HGV感染的血清学检测方法还不成熟。(二)庚型肝炎病毒RNA测定

[参考值]RT-PCR法为阴性

[临床意义]RNA阳性表明有HGV存在。五、庚型肝炎病毒标志物检测输血传播病毒(transfusiontransmittedvirus,TTV)是非囊膜单股环状DNA病毒，对TTV病毒的检测目前主要依靠PCR技术。

[参考值]PCR法为阴性

[临床意义]TTVDNA阳性表明有TTV存在六、输血传播病毒检测乙肝病毒标志物检测乙肝病毒结构：PreS1、S2

HBsAgHBcAgHBeAgHBV感染后免疫反应形成三种抗原抗体系统：

HBsAg----Anti-HBs(抗-HBs）

HBeAg----Anti-HBe(抗-HBe)HBcAg----Anti-HBc(抗-HBc)(一)生物学性状：DNA(二)传染源与传播途径：血液传播、性接触传播或母婴垂直传播(三)致病机制至今尚未阐明。国内外大量研究一致认为，HBV感染致肝脏受损并不是HBV在肝内复制繁殖的直接结果，而是机体对HBV表达产物的免疫应答所致，Chsari提出HBV感染诱导肝细胞损伤的免疫机制的假设：HBV感染人体后，可引起体液免疫和细胞免疫应答，并激发自身免疫反应和免疫调节紊乱，个体对HBV感染产生的不同免疫应答决定了HBV感染后的不同临床表现及转归：七、乙型肝炎病毒标志物检测(hepatitisBvirus,HBV)1．在个体产生免疫耐受时，表现为健康”携带者。2．个体产生强烈有效的抗病毒反应时，免疫反应呈一过性，则表现为急性肝炎；

3．在个体不能产生有效的抗病毒反应或由于初次强烈的免疫反应后变得衰竭，从而导致整个免疫反应很弱，则形成病毒的持久感染。(五)乙型肝炎病毒标志物检测1．乙型肝炎病毒表面抗原测定2．乙型肝炎病毒表面抗体测定3．乙型肝炎病毒e抗原测定4．乙型肝炎病毒e抗体测定5．乙型肝炎病毒核心抗原测定6．乙型肝炎病毒核心抗体测定7.乙型肝炎病毒表面抗原前S2和前S2抗体测定8.乙型肝炎病毒DNA测定1．乙型肝炎病毒表面抗原HBsAg测定HBsAg主要在感染HBV后1-2个月出现，可维持数周、数月至数年，也可长期存在。

[参考值]ELISA法、放免法(RIA)法及反向间接血凝法(RPHA)均为阴性。[临床意义]HBsAg阳性(1)急性乙肝的潜伏期;(2)乙肝急性期；

(3)慢性乙型肝炎;(4)肝炎后肝硬化或肝癌；

(5)HBV病毒携带者；

(6)传染性标志之一。2．乙型肝炎病毒表面抗体

(hepatitisBvirussurfaceantibody,抗-HBs)

是患者机体针对HBsAg所产生的一种抗体，它对HBsAg有一定的中和作用，表明机体具有一定的免疫力。[参考值]阴性或阳性[临床意义]①抗-HBs是一种保护性抗体，阻止HBV穿过细胞膜进入新的肝细胞，一般在发病后3－6月才出现，可持续多年，提示机体对乙肝病毒有一定程度的免疫力。②注射乙型肝炎疫苗或抗-HBs免疫球蛋白者，抗-HBs可呈现阳性反应。3．乙型肝炎病毒e抗原（HBeAg）测定[参考值]ELISA或RIA法均为阴性；[临床意义]HBeAg阳性（1）表明乙型肝炎处于活动期，并有较强的传染性，HBeAg已做为体内有HBV复制及血清具有强感染性的一个指标。孕妇HBeAg阳性可垂直传播致90％以上的新生儿呈HBeAg阳性。（2）HBeAg持续阳性，表明肝细胞损害较重，且可转为慢性乙型肝炎或肝硬化。如HBeAg转阴，表示病毒停止复制。（3）HBsAg、HBeAg和抗HBc阳性阳性称为大三阳。4．乙型肝炎病毒e抗体（抗-HBe）测定

*[参考值]ELISA或RIA法均为阴性；[临床意义]抗-HBe阳性率：在慢性乙型肝炎为48％，肝硬化68.3％，肝癌为80%。（1）抗-HBe阳性表示大部分乙肝病毒被消除，复制少，传染性减低，但并非无传染性。（2）判定病情：乙肝急性期即出现抗-HBe阳性，易进展为慢性乙型肝炎；慢性活动性肝炎出现抗-HBe阳性者可进展为肝硬化；HBeAg和抗-HBe均阳性，且ALT升高时可进展为原发性肝癌；（3）HBs-Ag、抗HBe和抗HBc阳性俗称小三阳。5．乙型肝炎病毒核心抗原（HBcAg）测定

[参考值]ELISA或RIA法均为阴性；[临床意义]HBcAg阳性，提示病人血清中有感染性的HBV存在，其含量较多，表示病毒复制活跃，传染性强，预后较差，约有78％的阳性病例病情恶化。6．乙型肝炎病毒核心抗体（抗-HBc）测定*（1）抗-HBc总抗体测定

[参考值]ELISA或RIA法均为阴性；

[临床意义]抗-HBc总抗体主要反映的是抗-HBcIgG。①HBsAg阴性：抗-HBc检出率比检测HBsAg更敏感，可作为HBsAg阴性的HBV感染的敏感指标。抗-HBc在乙型肝炎中检出率平均为78.8%，在慢性肝炎和肝癌中的检出率分别为97.8％和81.8%，在HBsAg携带者中，多为阳性，在HBsAg阴性的患者中仍有6％的阳性率。②安全性鉴定：抗-HBc检测也可作为乙型肝炎疫苗和血液制品安全性鉴定和献血员的筛选。③抗-HBcIgG对机体无保护性作用，其阳性可持续数十年甚至终身。(2)抗-HBcIgM测定[参考值]ELISA或RIA法均为阴性；[临床意义]急性乙型肝炎的发病期，血中抗-HBcIgM100%阳性，滴度较高，持续6-18个月。抗-HBcIgM既是乙型肝炎近期感染的指标，也是HBV在体内持续复制的指标，并提示病人血液有传染性。抗-HBcIgM阴转，预示乙型肝炎逐渐恢复；抗-H