基因诊断与治疗

第八章基因诊断与基因治疗第一节基因诊断

基因诊断(genediagnosis)是以DNA和RNA为诊断材料，通过检查基因的存在、缺陷或表达异常，对人体状态和疾病作出诊断的方法和过程。一、基因诊断的概念基因诊断的根本原理是检测DNA或RNA的结构变化与否，量的多少及表达功能是否正常，以确定被检查者是否存在基因水平的异常变化，以此作为疾病确诊的依据。1、核酸分子杂交关于核酸分子杂交的根本原理和根本类型前面已讲过。用于基因诊断的核酸分子杂交方法包括：

〔1〕Southern印迹法是最经典的基因分析方法，不但能检出特异的DNA片段，而且能进行定位和测定分子量，可用于基因的酶切图谱分析、基因突变分析等。〔2〕Northern印迹法可用于组织细胞中总RNA或mRNA的定性和定量分析。Southern印迹Northern印迹〔3〕斑点杂交可用于基因组中特定基因及其表达的定性及定量分析。优点：方法简单、快速、灵敏、样品用量少；缺点：是不能鉴定所测基因的分子量，特异性不高，有一定比例的假阳性。

〔4〕原位杂交可查明染色体中特定基因的位置，用于染色体疾病的诊断。原位杂交的结果是显示有关核酸序列的空间位置状况，因此可检出含核酸序列的具体细胞，也可检出基因和基因产物的亚细胞定位。2、聚合酶链式反响(PCR)单链构象多态性(singlestrandconformationpolymorphism，SSCP)检测是一种基于单链DNA构象差异来检测点突变的方法。3、单链构象多态性检测基因突变可能导致基因上某一限制酶识别位点的丧失或其相对位置发生改变，以此酶消化待测DNA和野生型对照DNA，通过比较二者的酶切片段的长度、数量上的差异就可判断待测DNA的突变情况。4、限制酶酶谱分析5、DNA序列测定〔二〕基因诊断的根本方法人类疾病的原因包括内因和外因两大类，内因主要是指遗传因素，即基因结构、表达状况的改变。其中基因结构的改变包括点突变、插入、缺失，重排、易位、基因扩增、基因结构多态性变异、前病毒插入等；外因是指外在的环境因素，如病原体的侵入等。因此，针对这些病因可采取相应的基因诊断方法，主要的可从以下几个方面着手：

①诊断的点突变：对于突变位点已被说明的一些遗传病，可以采用PCR／ASO(allelespecificoligonucleotide，ASO，等位基因特异性寡核苷酸)探针法进行检测。在扩增DNA片段后直接与相应寡核苷酸探针杂交，即可明确诊断是否有突变以及突变是纯合子还是杂合子。1、基因突变的诊断〔1〕点突变的诊断在该位点两端设计引物1、2进行PCR扩增，得到产物后进行斑点杂交或狭缝杂交。针对该突变分别合成一对寡核苷酸片段作为探针〔待检测的位点位于最中央〕：其中一个为正常探针，与正常序列互补；另一个是突变探针，与突变序列互补。3′突变位点5′引物2引物1寡核苷酸探针中央碱基与被探测的DNA上相应碱基或匹配或错配，对二者结合力影响最大。严格控制杂交及洗脱条件，使只有与靶序列完全互补的探针才能结合在等位基因片段上，而中央碱基与靶序列不匹配的探针那么不能结合在等位基因片段上。结果分析：a.如果从受检者DNA扩增的PCR产物只与正常探针杂交，表示受检者不存在这种突变基因；b.如果只有突变探针可以杂交，那么说明突变基因是纯合子；c.假设正常探针与突变探针都可杂交，说明突变基因是杂合子；d.如果患者的DNA与正常探针以及所有突变基因的寡核苷酸探针均不能杂交，那么提示患者的缺陷基因不属于先前已发现的突变类型，而很可能是一种新的突变类型。ATCG芯片设计探针定位新突变新突变〔杂合子〕〔纯合子〕C→T正常C→TC→GC→A点突变检测荧光亮点模式

可采用PCR／SSCP／sequencing方法。②诊断未知的突变〔2〕少数核苷酸缺失或插入的诊断可以采用检测点突变的方法。〔3〕大片段丧失或插入的诊断5′3′致病基因引物1引物2引物3引物4引物1和2：可确定有无缺失及缺失片段的相对大小。引物3和4：确定缺失部位。引物3和4的设计要通过研究来加以确定。对于一些较长的基因，设计两端引物(1和2)进行扩增是不适宜的，PCR扩增2kb以上的片段比较困难。在这种情况下可采用多重PCR的方法。利用PCR可以检测基因重排，其前提是重排基因和重排位点的序列。〔4〕基因重排(染色体易位)的诊断以待测基因的DNA片段或cDNA片段作为探针，采用适当的限制酶将基因组DNA进行酶切，通过Southern印迹杂交分析。假设基因组中该基因(或DNA片段)的拷贝数发生改变，杂交后显示的条带位置会发生改变，对放射性自显影条带进行吸光度扫描，可进行基因定量。〔5〕基因扩增的诊断

在人群中，个体间基因组的核苷酸序列存在着差异性，称为DNA的多态性。突变、重排、单个核苷酸的插入或缺失可使DNA顺序发生改变。其中有些可能造成限制酶切位点的增加、缺失或易位，致使DNA分子的限制酶切位点数目、位置发生改变。用限制酶切割基因组时，所产生的限制性片段的数目和每个片段的长度就不同，这就是限制性片段长度多态性(restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP)。能导致限制性片段发生改变的酶切位点又称为多态性位点。

2、多态性分析〔1〕限制性片段长度多态性分析

①限制酶酶切图谱直接分析法

适用于分析点多态性、核苷酸的缺失、插入或重组引起的多态性，可用于诊断疾病基因结构多态性变异已经明确的疾病。

RFLP分析法主要有限制酶酶切图谱直接分析法和RFLP间接分析法。②RFLP间接分析法大多数由基因缺陷引起的遗传性疾病的基因结构、突变情况和基因产物等遗传根底并不清楚，不能应用限制酶酶切图谱直接分析法进行诊断，而需要采用基因连锁分析。人类基因的基因内或旁侧序列存在许多重复序列(如微卫星DNA2-6个碱基重复序列、小卫星DNA6-12个碱基重复序列等)，由于重复单位的数目不同而形成多态性。已发现一些基因结构或表达异常与这些重复序列相关。对这些重复序列的多态性分析也成为基因诊断的重要依据。如果重复序列两侧的DNA序列，即可根据这些序列设计PCR引物，通过PCR产物的电泳分析来检测重复序列的多态性。〔2〕DNA重复序列多态性分析

结构基因变异可引起疾病，基因表达过程发生异常亦可引起疾病。通过RNA诊断可对待测基因的转录产物(mRNA)进行定性、定量分析，检测其转录和加工的缺陷以及外显子的变异等，既可用于疾病的诊断，也可用于基因治疗效果的监测。常用的诊断方法有如下几种：

3、基因表达异常的诊断①斑点杂交或狭缝杂交：②RT-PCR(逆转录PCR)法:〔1〕mRNA的相对定量分析〔2〕mRNA的绝对定量分析可采用RT-PCR/竞争性PCR的方法〔3〕mRNA长度分析可采用Northern杂交法4、外源DNA检测〔一〕遗传性疾病的种类1、染色体病〔染色体或数目改变〕2、单基因病3、多基因病〔二〕遗传性疾病基因诊断的策略三、遗传病的基因诊断

现已证实，所有遗传性疾病都是由于某种基因的缺失或变异所致。对这类疾病进行基因诊断可采取两种策略：直接诊断策略和间接诊断策略。

遗传性疾病通常的检测诊断方法：

1、DNA检测与分析2、RNA检测与分析〔三〕遗传性疾病检测方法〔一〕感染性疾病的种类1、病毒性疾病2、细菌性疾病3、寄生虫疾病〔二〕感染性疾病基因诊断的策略四、感染性疾病的基因诊断〔二〕检测方法〔以肝炎为例〕1、检测肿瘤相关基因2、检测肿瘤相关病毒的基因3、检测肿瘤标志物基因或mRNA。肿瘤的发生开展是多因素、多基因、多阶段相互协同作用的癌变过程，其关键是人类细胞基因组本身出现异常。目前，肿瘤的基因诊断可采取以下策略。五、肿瘤的基因诊断〔一〕肿瘤基因诊断的策略1、ras癌基因的检测2、抑癌基因p53的检测3、其它基因的检测〔二〕肿瘤相关基因的检测六、基因诊断在法医学中的应用〔一〕法医学鉴定的分子根底基因组DNA核苷酸的差异〔DNA的多态性〕〔二〕DNA指纹与法医学鉴定针对重复序列人工合成寡核苷酸短片段作为探针，与经过酶切的人基因组DNA进行Southern杂交，得到的杂交带图谱具有个体特异性。第二节基因治疗

随着在细胞分子水平上对疾病发病机制认识的深入，基因治疗已成为目前医学分子生物学最重要的研究领域之一。人类基因治疗最初着眼于遗传病。1990年开始对腺苷酸脱氨酶(ADA)缺陷所致的先天性免疫缺陷综合症进行体细胞基因治疗并初见成效。随后基因治疗研究逐渐广泛开展于多种遗传病(如血友病等)、恶性肿瘤、传染病(如艾滋病)、心血管疾病和糖尿病等基因治疗(genetherapy)是指通过在特定靶细胞中矫正缺陷基因，表达该细胞本来不表达的基因，或采用特定方式关闭、抑制异常表达基因，到达治疗疾病目的的治疗方法。策略：基因置换基因添加基因干预在基因治疗研究的早期，基因治疗是将目的基因导入靶细胞后与宿主细胞内的基因组发生整合，成为宿主遗传物质的一局部，目的基因表达产物起到对疾病的治疗作用。一、基因治疗的概念二、基因治疗研究的主要内容与策略〔一〕基因标记基因标记(genelabeling)实验是基因治疗的前奏。标记假定对患者有治疗作用的细胞，用标记实验验证两个问题：①外源基因是否平安地转移到患者体内；②从患者体内取出的细胞能否检测到转移基因的存在。neo外源基因G418

所谓基因置换(genereplacement)或称基因矫正(genecorrection)，是指将特定的目的基因导入特定的细胞，通过定位重组，以导入的正常基因置换基因组内原有的缺陷基因。基因置换的目的是纠正缺陷基因，将缺陷基因的异常序列进行矫正，对缺陷基因的缺陷部位进行精确的原位修复，不涉及基因组的任何改变。〔二〕基因置换基因添加或称基因增补(geneaugmentation)是通过导入外源基因使靶细胞表达其本身不表达的基因。基因添加有两种类型：一是针对特定的缺陷基因导入其相应的正常基因，使导入的正常基因整合到基因组中，而细胞内的缺陷基因并未除去，通过导入的正常基因表达正常产物，从而补偿缺陷基因的功能；二是向靶细胞中导入靶细胞本来不表达的基因，利用其表达产物到达治疗疾病的目的。例如，将细胞因子基因导入肿瘤细胞进行表达，即属于这一类型。(三)基因添加基因干预(geneinterference)是指采用特定的方式促进或者抑制某个基因的表达，以到达治疗疾病的目的。较常用的方法是采用反义核酸或反义核酸加核酶，抑制基因的表达。此类基因治疗的靶基因往往是过度表达的癌基因或者是病毒的基因。(四)基因干预三、基因转移的方法基因治疗的步骤包括目的基因克隆、基因转移和临床试验观察等。其中基因转移是基因治疗的关键。基因导入体内按照转移途径的不同可分为直接体内法〔invivo〕和间接体内法〔exvivo〕。直接体内法：将基因直接导入体内的各种体细胞中。间接体内法：将外源基因在体外转染病人靶细胞后，再将转染的靶细胞回输到病人体内的方法。将基因导入细胞的方法可以分为:

1.非载体法质粒DNA注射、体内电穿孔等。2.非生物载体法脂质体、微粒子、基因活化基质

3.非病毒性生物载体法配体、基因疫苗

4.病毒载体法逆转录病毒载体、腺病毒载体、单纯疱疹病毒载体等四、靶细胞的选择选择适宜的细胞作为基因转染的靶细胞是基因治疗成功的重要因素。选择靶细胞需考虑的因素：1〕选择目的基因表达的细胞最好是组织特异性细胞，或者表达后能分泌或以其他方式进入靶细胞；2〕细胞易获得，且生命周期较长；3〕细胞较易转染；4〕离体细胞经转染和一定时间培养后再植回体内仍较易成活。可供选择的靶细胞有两大类：生殖细胞和体细胞。

目前常用的靶细胞：骨髓造血干细胞具有再生殖能力，且与许多遗传病有关皮肤成纤维细胞具有长期自我更新能力肌细胞目前唯一用于DNA直接转移的组织细胞肝细胞与很多遗传病有关，且是肿瘤高发部位。淋巴细胞与免疫缺陷疾病、肿瘤有关，容易取出和回输血管内皮细胞表达产物直接进入血流。生殖细胞能彻底根治遗传病，但存在平安性问题基因治疗方案用于人体之前必须进行三个阶段的试验，即体外研究、小鼠体内研究和灵长类动物体内研究，以保证对人体无害。〔一〕遗传病的基因治疗研究目前发现的单基因病至少已有6000余种，其中有临床改变的遗传病约3000种。随着人们生活条件与医疗水平的提高，多种传染病得到控制，而遗传病的危害逐渐突出。应用：人类历史上第一种进行基因治疗的疾病是腺苷脱氨酶缺乏症，该病的基因治疗是一个较成功的范例。五、基因治疗的应用研究从1984年开始研究。1990年，美国RAC与FDA批准了ADA缺陷的基因治疗。临床基因治疗于当年开始。第一个接受基因治疗的是一个4岁女孩。患儿从1990年9月起的10个半月中，共接受了7次自体细胞输注，同时每周注射PEG-ADA，患儿免疫功能增强，临床病症改善。肿瘤是一种非常复杂的疾病，因此，肿瘤基因治疗的