结核分枝杆菌分子生物学检测技术介绍-欧喜超

结核分枝杆菌分子生物学检测技术介绍

欧喜超国家参比实验室何为分子诊断技术？利用标本中的核酸作为检测对象，对感染性疾病、肿瘤、遗传性疾病等进行诊断的方法。

特点：特异性强、灵敏度高、检测时间短DNARNA分子诊断主要步骤样品处理（核酸提取）：分子诊断的瓶颈扩增（PCR、恒温扩增）与杂交检测（电泳、荧光、浊度、染色、试纸条）分子生物学检测技术主要分类根据检测靶标的不同，可以将其分为两类：一类是检测靶标为DNA的

核酸扩增检测技术，另一类是检测靶标为RNA的核酸扩增检测技术。根据核酸扩增反应中温度变化要求，可以将其分为两类：一类是PCR

核酸扩增技术，另一类是核酸恒温扩增技术。核酸恒温扩增检测技术主要分类DNA恒温扩增检测技术：DNA在60～65℃温度范围处于动态平衡状态，

任何一个引物向双链DNA互补部位进行碱基配对延伸时，另一条链就

会解离，变成单链。RNA恒温扩增检测技术：在同一温度(42℃)，以RNA为起始模板，通

过逆转录酶产生一个双链DNA拷贝，然后利用RNA多聚酶从该DNA拷贝

产生多个RNA拷贝，每个RNA拷贝再从反转录开始进入下一轮循环。核酸恒温扩增检测优点：灵敏度和特异度高、方便快速、成本低。缺点：不能进行长链DNA扩增及产物回收鉴定、易污染。核酸恒温扩增PCR核酸扩增一个温度（℃）产物产物三个不同温度（℃）SDA:StrandDisplacementAmplification(DNA,BectonDickinson)

NASBA:NucleicAcidSequence-BasedAmplification(RNA,OT)

RCA:RollingCircleAmplification(DNA,MolecularStaging)

LAMP:Loop-MediatedIsothermalAmplification(DNA,Japan)

TMA:TranscriptionMediatedAmplification(RNA,Gen-Probe)

HDA：Helicase-DependantAmplification(DNA,Biohelix,NEB)

CPA:

CrossPrimingAmplification(DNA/RNA,优思达)

SAT:

SimultaneousAmplificationandTesting(RNA,仁度)核酸恒温扩增检测技术结核分枝杆菌分子生物学检测技术

结核分枝杆菌分子生物学检测与痰涂片、培养等病原学检测

互为补充，提高结核病诊断的准确性和及时性。结核分枝杆菌复合群（MTBC）各成员基因组序列具有高度的

同源性，目前临床分子生物学检测一般仅检测MTBC存在与否。

结核分枝杆菌耐药分子检测技术，通过检测耐药基因来判断

其对抗结核药物的耐药性，比传统药敏试验更加快速。结核分枝杆菌特有保守基因IS6110rpoB16SrRNAMPB64、Rv0069c、Rv3133c、hsp65……结核分枝杆菌耐药相关基因利福平（RFP）：rpoB异烟肼（INH）：KatG、inhA、ahpC结核分枝杆菌分子生物学检测技术一、环介导等温扩增检测（LAMP）二、交叉引物恒温扩增检测（CPA）三、实时荧光恒温扩增检测（SAT）四、多色半巢式实时荧光定量检测（GeneXpert）五、线性探针耐多药检测（LPA）六、基因芯片耐多药检测（GeneChip）七、熔解曲线耐多药检测（HRM）结核分枝杆菌常用分子生物学检测技术靶基因六个特异部位四条引物一、环介导等温扩增检测-1（PURE-LAMP）一、哑铃状（循环）模板合成阶段二、循环扩增阶段三、伸长和再循环阶段超快速提取纯化(PURE)与LAMP

检测试剂盒相结合手动操作灵敏、快速与显微镜检一样，直接检测痰液POC

检测15荣研PURE-LAMP检测试剂盒

核酸超快速提取纯化装置（ProcedureforUltraRapidExtraction）蛋白质等DNA吸取60微升痰标本加热管（90度5分钟）吸附管注射帽反应管LAMP反应仪LAMP反应纯化装置结果判读结核分枝杆菌PURE-LAMP检测简易操作流程（荣研）XichaoOu,QiangLi,HuiXia,etal.DiagnosticAccuracyofPURE-LAMPtestforPulmonaryTuberculosisattheCountyLevellaboratoryinChina.PLOSONE,2014.PerformanceofthePURE-LAMPtestforTBdetectioninTBsuspectsbasedonspotsputum.荣研LAMP检测多中心评估结果靶基因7个特异部位六条引物等温多自配体引发扩增反应（IMSA）一、环介导等温扩增检测-2（IMSA-LAMP）

第I阶段中间体SMS的生成阶段

第II阶段SMS-1结构的循环扩增示意图IMSA反应中基于SMS-2、SMS-3和SMS-4结构的循环扩增与SMS-1相似1.痰标本液化2.离心去上清3.离心清洗4.加入DNA提取液5.100℃加热10min6.离心取上清7.加入模板和对照样品到反应管8.加入密封液9.上机扩增反应10.结果判读等温多自配体引发扩增反应简易操作流程(迪澳,DeFast.TB)核酸提取装置样品管挤压管完整结构全程封闭，无病原暴露快速高效，适合基层使用

等温多自配体引发扩增反应简易操作流程(迪澳,DeFast.TB)①等温多自配体引发扩增反应简易操作流程(迪澳,DeFast.TB)恒温扩增荧光检测仪①信息扫码输入，减少人工记录误差。②安卓操作系统，操作界面人性化。③内置核心算法，扩增曲线实时绘制和

结果自动判读，减少人工判读误差。④检测结果存储及上传，实现患者诊断

结果网络化。PerformanceofRealAmptestforMTBdetection.迪澳LAMP检测多中心评估结果XichaoOu,ShengfenWang,HaiyanDong,etal.Multicenterevaluationofareal-timeloop-mediatedisothermalamplification(RealAmp)testforrapiddiagnosisofMycobacteriumtuberculosis.JournalofMicrobiologicalMethods,2016.二、交叉引物恒温扩增检测（CPA）3’5’置换引物交叉引物1交叉引物2置换引物5’5’3’5’交叉引物设计5’AGGGACATAACAATGGTATTTGTTGGGGTAATCAACTGTTTGTTACTGTGGTAGATACCACACGCAGTACCAACATGACATTATGTGCATCCGTAACTACATCTTCCACATACACCAATTCTGATTATAAAGAGTACATGCGTCATGTGGAAGAGTATG3’

A2 S1正向交叉引物1:5’-CATACTCTTCCACATGACGCAGGGACATAACAATGGTATTTG-3’逆向交叉引物2:5’-AGGGACATAACAATGGTATTTGCATACTCTTCCACATGACGC-3’

S1 A2正向引物位点1特异性模板序列逆向引物位点2生物素标记探针FitC标记探针模板序列和交叉引物设计BSTDNA聚合酶具有链置换功能5’5’S1A2A23’A15’交叉引物浓度较高，先杂交置换引物浓度较低，后杂交5’A23’5’S1A23’S2A15’BSTDNA聚合酶交叉引物延伸置换引物延伸置换引物剥离交叉引物5’5’3’S1A2S2S1A25’交叉引物先延伸置换引物后延伸置换引物剥离交叉引物5’3’A1A2S2S1生成3’末端和5’末端固定的新模板两端各加入新的交叉引物杂交位点一、启动阶段（带有交叉引物位点的扩增产物产生）5’3’A1A2S2S15’S1A2A2S15’S1S2A2A13’A2S1S1A25’S15’5’5’5’3’A1A1A2S2S15’S1A2A2S1A2A2S1S1S2A2A13’A2S1S1A25’5’S1A2A2S15’5’多重引物杂交位点多条引物杂交延伸、相互剥离、快速扩增扩增产物长短不一、结构多种多样包括单链、双链及分枝DNA。扩增产物都带有特异性的检测序列。A1A2S2S15’3’A15’S1A2A2S15’5’S1A2A2S15’S2A2S1A2S15’S1A25’A2S15’3’A1A2S2S1新模板二、指数扩增阶段三、可检测的扩增产物试纸条检测试纸条检测5’3’A1A2S2S13’5’S1A2S2A1S1S15’5’S1A25’3’5’5’3’5’3’5’3’5’5’3’5’3’5’单、双链及分枝的DNA产物有些产物较小，有些很大，多为重复序列扩增终产物双重标记，用于试纸条检测A1A2S2S15’3’A15’S1A2A2S15’5’S1A2A2S15’S2A2S1A2S15’S1A25’A2S1全封闭式核酸扩增产物快速检测装置一次性试纸条核酸快速检测免疫层析显色法技术（2选1）（3选1）自动提取试剂单人单份结核分枝杆菌恒温扩增试纸条法简易操作流程（优思达）优思达CPA检测效能初步分析SensitivityandspecificityoftheCPAassayandL-JculturemediumforclinicalspecimensbyAFBsmearand3Dliquidcultureresults.RendongFang,XiaLi,LinHu,etal.Cross-PrimingAmplificationforRapidDetectionofMycobacteriumtuberculosisinSputumSpecimens.JournalofClinicalMicrobiology,2009.优思达CPA检测多中心评估结果SensitivityandspecificityoftheCPAtestfromTBsuspects,ascomparedwithsolidculture.XichaoOu,YuanyuanSong,BingZhao,etal.AmulticenterstudyofCrossPrimingAmplificationfortuberculosisdiagnosisatperipherallevelinChina.Tuberculosis,2014.三、实时荧光恒温扩增检测（SAT）通过M-MLV反转录酶产生靶标核酸（RNA）的一个双链DNA拷贝，利用T7RNA多聚酶从该DNA拷贝上产生多个RNA拷贝；每一个RNA拷贝再从反转录开始进入下一个扩增循环；同时，带有荧光标记的探针和这些RNA拷贝特异结合，产生荧光。TB-SAT检测主要优势恒温扩增：42℃活菌检测：RNA扩增交叉污染少：靶标和扩增物都是RNA极高的扩增效率：rRNA为靶标，提高了取样效率和检测灵敏度。反应稳定：抑制物少一个或几个拷贝DNA104核糖体RNA(rRNA)16SrRNA23SrRNATB-SAT检测结果判定阴性结果阳性结果RNA实时荧光恒温扩增检测简易操作流程（仁度）TB-RNA释放恒温扩增实时检测超声波（300W）15min痰液预处理42℃40min50µl稀释液与反应液混合60℃10min42℃5minRNA实时荧光恒温扩增检测效能初步分析PerformancesofSAT-TBandBactecMGIT960culturemethodswithclinicalsputumspecimens.ZhenlingCui,YongzhongWang,LiangFangal,etal..NovelReal-TimeSimultaneousAmplificationandTestingMethodToAccuratelyandRapidlyDetectMycobacteriumtuberculosisComplex.JournalofClinicalMicrobiology,2012.GeneXpert检测系统由美国Cepheid公司研发，可完成多种病原微生物的检测。六大特性：集成性、快捷性、灵活性、易操作、安全性和精确性。

四、多色半巢式实时荧光定量检测GeneXpert检测采用完备独立的反应盒。GeneXpert反应盒GeneXpert模块是一个独立，可控温的荧光计，可对进行中的PCR反应进行实时监测。每一个模块都具有六个光谱，可检测一个反应管中的多种荧光染料。每一个反应单元都相互独立。每一个样品都拥有各自不同的程序。GeneXpert反应模块XpertMTB/RIF检测原理XpertMTB/RIF核酸检测采用Cepheid公司GeneXpert检测系统，是一种半巢式实时荧光定量PCR体外诊断技术，针对rpoB基因81bp利福平耐药核心区间（RRDR）设计引物、探针，检测其是否发生突变，进而用于诊断患者是否结核以及是否对利福平耐药（rpoB序列存在突变）。•可同时检测患者是否结核以及是否对利福平耐药•对涂阴培阳病人具有非常高的敏感性和特异性•两小时内即可得到检测结果，所用仪器设备简单原理痰标本与处理液1：2混合吸取2ml处理样品到反应盒将反应盒放入检测模块（手工操作完成）标本自动清洗过滤超声裂解DNA提取DNA和PCR反应试剂混合半巢式实时荧光定量核酸扩增打印检测报告获得检测结果时间：1小时45分钟XpertMTB/RIF检测效能多中心评估结果DiagnosticperformanceoftheMTB/RIFforthedetectionofMTBinsuspectednon-MDR-TBcases.XichaoOu,HuiXia,QiangLi,etal.AfeasibilitystudyoftheXpertMTB/RIFtestattheperipherallevellaboratoryinChina.InternationalJournalofInfectiousDiseases,2015.XpertMTB/RIF检测效能多中心评估结果DiagnosticperformanceoftheMTB/RIFforthedetectionofMTBinsuspectednon-MDR-TBcases.XichaoOu,HuiXia,QiangLi,etal.AfeasibilitystudyoftheXpertMTB/RIFtestattheperipherallevellaboratoryinChina.InternationalJournalofInfectiousDiseases,2015.XpertMTB/RIF检测效能多中心评估结果DiagnosticperformanceoftheMTB/RIFforthedetectionofrifampinresistanceinsuspectednon-MDR-TBcasesandMDR-TBcases.XichaoOu,HuiXia,QiangLi,etal.AfeasibilitystudyoftheXpertMTB/RIFtestattheperipherallevellaboratoryinChina.InternationalJournalofInfectiousDiseases,2015.XpertMTB/RIF检测效能荟萃分析结果ForestplotsofsensitivityandspecificityforXpertMTB/RIFassay.KaiChang,WeipingLu,JunjiWang,etal.RapidandeffectivediagnosisoftuberculosisandrifampicinresistancewithXpertMTB/RIFassay:Ameta-analysis.JournalofInfection,2012.五、线性探针耐多药检测检测是否感染结核分枝杆菌，并检测是否耐利福平和异烟肼。良好的灵敏度和特异性易污染操作复杂：总时间8h（DNA提取0.5h、PCR扩增2.5~3h、探针杂交1~2h、结果判读0.5h）线性探针技术检测原理多重PCR：4对引物包括16s鉴定、rpoB、katG和inhA基因检测多条探针：27条（野生和突变）碱基配对原则：A-T,C-G放大显色效应确定耐药性DNA提取用NALC/NaOH处理痰标本2)PCR扩增3)

杂交扩增产物和固化在膜上的特异性探针杂交4)

结果判读线性探针技术简易操作流程线性探针检测效能多中心评估结果PerformanceofHainLPAfortherifampincinandisoniazidresistancedetection.LIQiang,DONGHaiYan,PANGYu,etal.MulticenterEvaluationoftheMolecularLineProbeAssayforMultidrugResistantMycobacteriumTuberculosisDetectioninChina.BiomedEnvironSci,2015.基因芯片：基于特定基因位点突变与耐药性的相关性，通过PCR扩增和核酸杂交技术，检测荧光信号的有无，判断特定位点的突变情况和细菌耐药性的检测方法。结核分枝杆菌耐药检测基因芯片：基于rpoB/katG/inhA的基因突变，快速检测分离株或者痰样本中结核杆菌耐药性（利福平、异烟肼）。六、基因芯片耐多药检测基因芯片耐多药检测简易流程芯片结果图例芯片杂交质控芯片制备质控芯片制备质控芯片杂交质控靶基因扩增质控阴性对照质控空白对照质控基因芯片检测效能多中心评估结果PerformanceofGenechipfordetectingrifampinresistance.YuPang,HuiXia,ZhiyingZhang,etal.MulticenterEvaluationofGenechipforDetectionofMultidrugResistantMycobacteriumtuberculosis.JournalofClinicalMicrobiology,2013.基因芯片检测效能多中心评估结果PerformanceofGenechipfordetectingisoniazidresistance.YuPang,HuiXia,ZhiyingZhang,etal.MulticenterEvaluationofGenechipforDetectionofMultidrugResistantMycobacteriumtuberculosis.JournalofClinicalMicrobiology,2013.七、熔解曲线耐多药检测PCR1Multicolor:多个荧光探针共存一管Wild-typeMutant-typeMutant/Wild-type匹配度最好时，Tm值最高发生错配后，Tm值下降既有野生又有突变时，出现两个熔解峰探针游离时为淬灭状态熔解分析2Melting:扩增后运行熔解曲线分析Curve:突变和熔点相对应96%利福平耐药突变发生在rpoB507-533共81bp区域内利福平耐药突变检测体系示意图异烟肼耐药突变检测体系示意图样品提取

PCR反应液配制加样上机结果分析将PCRMix与Taq酶混匀后，分装入PCR反应管。以Lab-Aid820核酸提取系统提取模板DNA。每个样品的反应管A、B中分别加入模板5uL。进入扩增区上机运行扩增和熔解曲线分析程序。操作软件，选择荧光通道和样本位置，读取结果。熔解曲线检测技术简易操作流程2-3核酸提取PCR检测结果耗时<3小时痰标本液化、裂解预处理高效液化：一次液化，同时满足细菌培养及核酸提取应用需求；5min高质量的样本DNALab-Aid核酸提取系统自动提取，保证均一性，减少人为误差高纯度DNA样本利于长期保存8连管预分装试剂条，只需揭开封膜即可使用1条试剂条，处理1份样本MeltPro®

结核病分子诊断系统Lab-Aid

824

结核分枝杆菌核酸提取试剂盒和核酸提取仪MeltPro结核基因检测试剂盒全自动医用PCR分析系统，软件自动报告结果熔解曲线检测效能多中心评估结果PerformanceofMeltProfordetectingrifampin-resistance.YuPang,HaiyanDong,YaojuTan,etal.RapiddiagnosisofMDRandXDRtuberculosiswiththeMeltProTBassayinChina.ScientificReports,2016.熔解曲线检测效能多中心评估结果Perform