线粒体呼吸链复合体Ⅳ活性检测试剂盒实验解决方案

线粒体呼吸链复合体Ⅳ活性检测试剂盒实验解决方案原理线粒体呼吸链复合体Ⅳ又称细胞色素C氧化酶，也是线粒体电子传递呼吸链主路和支路的共有成分，负责催化还原型细胞色素C的氧化，并最终把电子传递给氧，生成水。CheKine™线粒体呼吸链复合体Ⅳ活性检测试剂盒（微量法）可检测生物体内线粒体呼吸链复合体Ⅳ活性，其原理是还原型细胞色素C在550nm有特征光吸收，线粒体呼吸链复合体Ⅳ催化还原型细胞色素C生成氧化型细胞色素C，因此550nm光吸收下降速率能够反映线粒体呼吸链复合体Ⅳ酶活性。可测动、植物组织和细胞样本。自备耗材·酶标仪或可见分光光度计（能测550nm处的吸光度）·恒温箱、制冰机、低温离心机·96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头·去离子水·匀浆器或研钵试剂准备ReagentⅠ：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。ReagentⅡ：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。ReagentⅢ：即用型；使用前，平衡到室温；4℃避光保存。工作液的配制：临用前，将ReagentⅤ和ReagentⅥ依次转移到ReagentⅣ中混合溶解，如果检测样本是哺乳动物来源，请置于37℃孵育5min；如果样本是其他物种，则置于25℃孵育5min。用不完的试剂分装后-20℃避光保存1周，禁止反复冻融。样本制备注意：推荐使用新鲜样本，以保证酶的活力。线粒体呼吸链复合体Ⅳ的提取：准确称取0.1g组织或收集500万个细胞，加入1mLReagentⅠ和10µLReagentⅢ，用匀浆器或研钵冰浴匀浆。离心匀浆液，600g，5min，4℃，收集上清液至另一新的离心管中，舍弃沉淀。再次离心上清，11,000g，10min，4℃，沉淀即为提取的线粒体，用作第5步操作。(选做)上清液即为胞浆提取物，可作为样本用于测定从线粒体泄漏的线粒体呼吸链复合体Ⅳ，用于判断线粒体提取效果。在沉淀中加入200µLReagentⅡ和2µLReagentⅢ，充分重悬沉淀，用于下一步线粒体呼吸链复合体Ⅳ酶活性检测。实验步骤酶标仪和可见分光光度计预热30min以上，调节波长至550nm，可见分光光度计用去离子水调零。在96孔板或微量玻璃比色皿中依次加入200µL工作液和10µL样本，充分混匀后，立即读取550nm处0min的初始吸光值A1和1min后的吸光值A2，计算ΔA=A1-A2。注意：1.为保证实验结果的准确性，需先取1-2个样做预实验，如果ΔA过高（高于1.0），可用ReagentⅡ稀释样本后再测定，计算结果时注意乘以稀释倍数。若ΔA偏小，则可以通过增加加入的样本体积来提高检测数值，若ΔA出现负值，则说明样本中不含复合体Ⅳ或已降解。2.线粒体呼吸链试剂盒是酶动力学原理的试剂盒，反应比较快，且反应趋于平衡之后，该可逆反应可能会出现负反应，建议如下：（1）样本组数：2-3个左右，该酶促反应速度快，且为酶促反应，需要把握好起始时间点和反应后的时间点；（2）仪器提前预热，且加样可安排在酶标仪旁边进行，加样混匀后直接放入；（3）如果ΔA偏小，可增加样本量（组织克重或者细胞数量），或者减少提取液用量；（4）样本尽量新鲜提取，如果不能马上使用，则把完整细胞或者分装的组织保存在-80℃，一个月内使用；（5）工作液临用前配制。3.该试剂盒提取的样本也可以适用于KTB1850、KTB1860、KTB1870、KTB1890的测定。结果计算注意：我们为您提供的计算公式，包括推导过程计算公式和简洁计算公式。两者完全相等。建议以加粗的简洁计算公式为最终计算公式。1.使用96孔板测定的计算公式(1)按样本鲜重计算单位的定义：每g组织在反应体系中每分钟催化降解1nmol还原型细胞色素C定义为一个酶活力单位。上清中线粒体呼吸链复合体Ⅳ活力的计算：上清的复合体Ⅳ活力(U/g鲜重)=[ΔA上清×V反总÷(ε×d)×109]÷(W÷V提取×V样)÷T=2,221×ΔA上清÷W沉淀中复合体Ⅳ活力的计算:沉淀中的复合体Ⅳ活力(U/g鲜重)=[ΔA沉淀×V反总÷(ε×d)×109]÷(W÷V重悬×V样)÷T=444×ΔA沉淀÷W复合体Ⅳ总活力的计算：总复合体Ⅳ活力即为上清中线粒体呼吸链复合体Ⅳ活力与沉淀中线粒体呼吸链复合体Ⅳ活力之和。总复合体Ⅳ活力(U/g鲜重)=2,221×ΔA上清÷W+444×ΔA沉淀÷W(2)按细胞密度计算单位的定义：每1万个细胞每分钟催化降解1nmol还原型细胞色素C定义为一个酶活力单位。线粒体呼吸链复合体Ⅳ活力(U/104cells)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样÷V重悬×500)÷T=0.888×ΔAV反总：反应体系总体积，2.1×10-4L；ε：细胞色素C摩尔消光系数，19.1×103mol/L/cm；d：96孔板光径，0.5cm；109：单位换算系数，1mol=109nmol；V样：加入样本体积，0.01mL；T：反应时间，1min；ΔA上清：上清测定值；W：样本重量，g；V提取：提取体系体积，1.01mL；ΔA沉淀：沉淀测定值；V重悬：重悬沉淀体积，0.202mL；500：细胞总数，500万。2.使用微量玻璃比色皿进行测定的计算公式将上述计算公式中光径d:0.5cm调整为d:1cm进行计算即可。结果展示实验实例：取0.1g小鼠脑组织进行样本处理，按照测定步骤操作，用96孔板测得：ΔA上清=A1-A2=0.4568-0.4446=0.0122，ΔA沉淀=A1-A2=0.4373-0.4188=0.0185按样本质量计算得：上清中线粒体呼吸链复合体Ⅳ活性(U/g鲜重)=2,221×ΔA上清÷W=2,221×0.0122÷0.1=270.962U/g沉淀中线粒体呼吸链复合体Ⅳ活性(U/g鲜重)=444×ΔA沉淀÷W=444×0.0185÷0.1=82.14U/g则线粒体呼吸链复合体Ⅳ(U/g鲜重)=2,221×ΔA上清÷W+444×ΔA沉淀÷W=270.962+82.14=353.102U/g相关产品CatalogNo.ProductNameKTB1850CheKine™线