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1山羊痘病毒和绵羊痘病毒通用型荧光PCR检测方法NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范NY/T3186羊冷冻精液生产技术规程4缩略语实时荧光PCR：实时荧光聚合酶链式反应（Real-timepolymerasechaiCt值：每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值所经历的循环DNA：脱氧核糖核苷酸（DeoxyribonucleicacGPTV：山羊痘病毒（goatpoxviPBS：磷酸盐缓冲液（Phosphatebufferedsaline)25.1.375%乙醇，无水乙醇和双蒸水配制，-20℃预冷。5.1.48mMNaOH溶液，配制见附羊痘病毒的细胞悬液或者含有山羊痘和绵羊痘病5.1.12山羊痘和绵羊痘病毒阴性对照样品：采用绵羊羔睾6.3高速台式冷冻离心机：可控温至4℃、离37.2.3鼻拭子采集：用棉拭子取受检山羊或绵羊鼻腔分泌物，置于2mLPBS上述采集的样本可立即用于检测，样本在2℃~8℃下保存应不超过24h，-20℃±5℃可山羊痘和绵羊痘病毒荧光PCR检测的实验8.2.1DNA抽提使用DNAzol手工提取，也可以使用等效的商品化试剂盒提取，在核酸提取区操作。48.2.2取n个灭菌的1.5mL离心管，其中n为min。反复洗涤两次后，将离心管倒扣于吸8.2.6用30µL8mMNaOH之和，每个反应的体系见附录C，为了避免移液器取样损失，建议按n+1个反应进行配制。配制反应液于96孔板上，按顺序加样并做好标识，转移至在核酸提取区进行。在每个PCR反应管内加入5μLDNA模板，并分别加入本文件中710μLDNA溶液，盖上盖子，500r/min~1000r/min离心30s。转移至检测区。在检测区进行。将8.3.3中离心后的PCR管放入荧光PCR检测仪内，设置9结果判定9.2质量控制9.2.1阴性对照：无Ct值或无典型的特异性扩9.2.39.2.1和9.2.2要求须在同一次试验中同时满足，否则，本次试验无效，59.3结果判定9.3.3可疑核酸阳性，否则判定为山羊痘和绵羊痘病毒核6溶液配置将8.0gNaCl、0.2gKCl，1.44gNa2HPO4和0.24gKH2PO4依次加入到800mL蒸于室温。75’-CAGGAGGTGTTGAAAATTTTACAG-3’5’-CCGCATCGGCATACGATTTCC-3’5’-6-FAMACAAAGAGCATTACATAAT-3’-MGB’

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