KTB1119-CN-丙酮酸羧化酶（PC）活性检测试剂盒（微量法）

丙酮酸羧化酶（PC）活性检测试剂盒（微量法）原理丙酮酸羧化酶（Pyruvatecarboxylase，PC）广泛存在于动物、霉菌和酵母的线粒体中，但在植物体和大部分细菌中却不含此酶。PC是供给草酰乙酸的主要补充反应，是糖异生过程的第一个限速酶。CheKine™丙酮酸羧化酶（PC）活性检测试剂盒（微量法）可检测动物组织、细胞等生物样本。在该试剂盒中，PC不可逆的催化丙酮酸、ATP、CO2和水生成草酰乙酸、ADP和Pi，苹果酸脱氢酶进一步催化草酰乙酸和NADH生成苹果酸和NAD+，在340nm下测定NADH氧化速率，即可反映PC活性。包装清单试剂盒组分规格储存条件48T96TExtractionBuffer60mL60×2mL4℃ReagentⅠ10.8mL21.6mL4℃，避光保存ReagentIIPowder×1vialPowder×1vial4℃，避光保存ReagentIIIPowder×1vialPowder×1vial-20℃，避光保存ReagentIVPowder×1vialPowder×1vial-20℃，避光保存注意：正式检测前，建议选择2-3个预期差异较大的样本进行预实验。自备耗材·酶标仪或可见光分光光度计（能测340nm处的吸光度）·96孔UV板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头、1.5mL离心管·水浴锅、低温离心机·去离子水·匀浆器或研钵试剂准备ExtractionBuffer：即用型；使用前，平衡到室温。4℃保存。注意：ExtractionBuffer有毒且有刺激性气味，建议在通风橱进行实验。ReagentI：即用型；使用前，平衡到室温。4℃避光保存。ReagentII：即用型；使用前，平衡到室温。4℃避光保存。ReagentIII：即用型；使用前，平衡到室温。-20℃避光保存。ReagentIV：临用前配制；48T加入0.6mL去离子水，96T加入1.2mL去离子水，充分溶解待用。用不完的试剂-20℃避光分装保存1个月，避免反复冻融。WorkingReagent：临用前配制；用ReagentⅠ溶解ReagentII和ReagentIII，将溶解后的ReagentII和ReagentIII转移到ReagentⅠ中，充分溶解待用。用不完的试剂-20℃避光分装保存1个月，避免反复冻融样本制备注意：建议使用新鲜样本。如果不立即使用，可将样品在-80℃下保存一个月。测定时，应控制解冻的温度和时间。室温环境下解冻时，需在4h内完成样品解冻。动物组织或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：称取约0.1g样本或收集500万细胞，加入1mLExtractionBuffer，用匀浆器或研钵冰浴匀浆。将匀浆600g，4℃离心5min，弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11,000g，4℃离心10min，上清液即为除去线粒体的胞浆蛋白，可用于测定从线粒体泄漏的PC（可选做）。沉淀即为线粒体，加入1mLExtractionBuffer，超声波破碎（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次），用于线粒体PC测定。注意：如需测定蛋白浓度，推荐使用Abbkine货号：KTD3001的蛋白质定量试剂盒（BCA法）进行样本蛋白质浓度测定。实验步骤酶标仪或可见光分光光度计预热30min以上，调节波长到340nm，可见光分光光度计用去离子水调零。将WorkingReagent置于37℃(哺乳动物)或25℃（其它物种）预热5min。操作表（下述操作在96孔UV板或微量玻璃比色皿中进行）：试剂测定孔（μL）样本10ReagentIV10WorkingReagent180迅速混匀后，记录340nm处10s时吸光值A1和130s时的吸光值A2，计算ΔA=A2-A1。注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果ΔA小于0.01可适当加大样本量或延长反应时间。如果ΔA大于0.5，样本可用ExtractionBuffer进一步稀释，计算结果乘以稀释倍数，或减少提取用样本量。结果计算注意：我们为您提供的计算公式，包括推导过程计算公式和简洁计算公式。两者完全相等。建议以加粗的简洁计算公式为最终计算公式。使用96孔UV板测定的计算公式如下PC活性的计算按样本蛋白浓度计算：酶活单位定义：每毫克蛋白每分钟消耗1nmolNADH为1个酶活单位。PC上清(U/mgprot)=[ΔA上清×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样×Cpr)÷T=3,216×ΔA上清÷CprPC沉淀(U/mgprot)=[ΔA沉淀×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样×Cpr)÷T=3,216×ΔA沉淀÷Cpr总PC(U/mgprot)=PC上清+PC沉淀=3,216×ΔA上清÷Cpr+3,216×ΔA沉淀÷Cpr按样本鲜重计算：酶活单位定义：每克样本每分钟消耗1nmolNADH为1个酶活单位。PC上清(U/g鲜重)＝[ΔA上清×V反总÷(ε×d)×109]÷(W×V样÷V样总)÷T=3,216×ΔA上清÷WPC沉淀(U/g鲜重)＝[ΔA沉淀×V反总÷(ε×d)×109]÷(W×V样÷V样总)÷T=3,216×ΔA沉淀÷W总PC(U/g鲜重)=PC上清+PC沉淀=3,216×ΔA上清÷W+3,216×ΔA沉淀÷W按细胞数量计算：酶活单位定义：每104细胞每分钟消耗1nmolNADH为1个酶活单位。PC上清(U/g104cell)＝[ΔA上清×V反总÷(ε×d)×109]÷(n×V样÷V样总)÷T=3,216×ΔA上清÷nPC沉淀(U/g104cell)＝[ΔA沉淀×V反总÷(ε×d)×109]÷(n×V样÷V样总)÷T=3,216×ΔA沉淀÷n总PC(U/g104cell)=PC上清+PC沉淀=3,216×ΔA上清÷n+3,216×ΔA沉淀÷nΔA上清：上清测定值；ΔA沉淀：沉淀测定值；ε：NADH在340nm处摩尔吸光系数，6.22×103L/mol/cm；d：96孔板光径，0.5cm；V反总：反应体系总体积，2×10-4L；V样：加入样本体积，0.01mL；V样总：加入ExtractionBuffer体积，1mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W：样品质量，g；T：反应时间，2min；n：细胞总数，以万计。使用微量石英比色皿测定的计算公式将上述计算公式中光径d:0.5cm调整为d:1cm进行计算即可。结果展示以下数据仅供参考，实验者需根据自己的实验对样品进行检测。Figure1.本试剂盒测定兔心脏和肝脏中总PC的活性相关产品CatalogNo.Pro