KTB1720-CN-纤维素（CLL）含量检测试剂盒（微量法）

纤维素（CLL）含量检测试剂盒（微量法）原理纤维素（CLL）是由葡萄糖组成的大分子多糖，通常与半纤维素、果胶和木质素结合在一起，是植物细胞壁的主要结构成分。纤维素是一种重要的膳食纤维，是自然界中分布最广、含量最多的一种多糖。CheKine™纤维素（CLL）含量检测试剂盒（微量法）提供了一种简单、方便、快速的CLL活性检测方法，适用于植物组织样本。其原理是纤维素为β－葡萄糖残基组成的多糖，在酸性条件下加热能分解成β－葡萄糖。β－葡萄糖在强酸作用下，可脱水生成β－糠醛类化合物。β－糠醛类化合物与蒽酮脱水缩合，生成糠醛衍生物。颜色的深浅可间接定量测定纤维素含量。包装清单试剂盒组分规格储存条件48T96TReagentI60mL120mL4℃，避光保存ReagentIIPowder×1vialPowder×1vial4℃，避光保存ReagentIII3mL6mL4℃，避光保存StandardPowder×1vialPowder×1vial4℃注意：正式检测前，建议选择2-3个预期差异较大的样本进行预实验。自备耗材·酶标仪或可见光分光光度计（能测620nm处的吸光度）·烘箱、涡旋振荡仪、40目筛、水浴锅、分析天平、制冰机、低温离心机·96孔板（非聚苯乙烯材质）或微量玻璃比色皿·可调节式移液枪及枪头·去离子水、80%乙醇、丙酮、浓硫酸·匀浆器试剂准备ReagentI：即用型；使用前，平衡到室温；4℃避光保存。WorkingReagentII：临用前配制；48T加入2.8mLReagentIII，96T加入5.6mLReagentIII充分溶解，如较难溶解，可加热搅拌；用不完的试剂4℃保存一周。ReagentIII：即用型；使用前，平衡到室温；4℃避光保存。注意：ReagentI，ReagentII和ReagentIII有毒且有刺激性气味，建议在通风橱进行实验。Standard：临用前配制；加入1mL去离子水溶解，配成10mg/mL葡萄糖溶液备用，4℃可保存两周。标准品制备：10mg/mL葡萄糖溶液，按照下表所示，进一步稀释成标准品：序号Standard体积去离子水体积（µL）浓度（mg/mL）Std.125µL10mg/mLStandard9750.25Std.2500µLofStd.1(0.25mg/mL)5000.125Std.3500µLofStd.2(0.125mg/mL)5000.0613Std.4500µLofStd.3(0.0613mg/mL)5000.0306Std.5500µLofStd.4(0.0306mg/mL)5000.0153Std.6500µLofStd.5(0.0153mg/mL)5000.0077Std.7500µLofStd.6(0.0077mg/mL)5000.0038Std.805000（空白管）样本制备注意：推荐使用新鲜样本，如果不立即进行实验，样本可在-80℃保存数周。测定时，应控制解冻的温度和时间。室温环境下解冻时，需在4h内完成样品解冻。称取新鲜样品0.3g（记为W1），80℃烘干2h（可适当延长）至恒重，粉碎，过40目筛。烘干样本中加入1mL80%乙醇，90℃水浴20min（建议用封口膜封口或使用带螺旋盖的EP管），冷却至室温，8,000g25℃离心10min，弃上清。沉淀中加入1.5mL80%乙醇和丙酮各清洗一遍（涡旋振荡2min左右，8,000g25℃离心10min，弃上清），沉淀烘干后即为粗细胞壁，称其重量记为W2。称取上述粗细胞壁0.01g（记为W3）加入1mLReagentI，充分混匀，90℃水浴30min（建议用封口膜封口或使用带螺旋盖的EP管）。取出冷却后8,000g25℃离心10min，弃上清。沉淀中加入1mL去离子水混匀，涡旋振荡2min左右，8,000g25℃离心10min，弃上清，沉淀用去离子水重复清洗3次（加入1mL去离子水混匀，涡旋振荡2min左右，8,000g25℃离心10min，弃上清）。沉淀中加入1mL丙酮，混匀后8,000g25℃离心10min，弃上清，沉淀烘干待用。在上述烘干的沉淀中加入0.5mL去离子水溶解（如果不能充分溶解，可以适当匀浆或超声促进溶解），置于冰水浴中，缓慢加入0.75mL浓硫酸，混匀，冰水浴中静置30min，取部分上清液，用去离子水稀释20倍，8,000g4℃离心10min，取上清液待测。注意：部分样本中纤维素含量较低（淀粉含量较高），如米粉、板栗、甘薯等，可不稀释或减小稀释倍数。实验步骤酶标仪或可见光分光光度计预热30min，调节波长到620nm。可见光分光光度计用去离子水调零。调节水浴锅至95℃。操作表（下述操作在1.5mLEP管中进行）：试剂空白管（μL）测定管（μL）标准管（μL）上清液01500Standard00150去离子水15000WorkingReagentII353535浓硫酸315315315混匀，置于95℃水浴中10min（盖紧，以防止水分散失），冷却至室温后，取200μL上层液加入微量玻璃比色皿或96孔板（非聚苯乙烯材质），于620nm处测定吸光值，分别记为A空白、A测定和A标准。计算ΔA测定=A测定-A空白，ΔA标准=A标准-A空白。注意：标准曲线和空白管只需测1-2次。实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果ΔA测定小于0.03可减小稀释倍数或适当加大样本量，如果ΔA测定大于1.0，样本可用去离子水进一步稀释，计算结果乘以稀释倍数，或减少提取用样本量。结果计算注意：我们为您提供的计算公式，包括推导过程计算公式和简洁计算公式。两者完全相等。建议以加粗的简洁计算公式为最终计算公式。标准曲线的绘制以标准溶液浓度为x轴，ΔA标准为y轴，绘制标准曲线，得到标准方程，将ΔA测定带入方程得到x(mg/mL)。CLL含量的计算按样本鲜重计算CLL(mg/g鲜重)=x×V提取×20×(W2÷W3)÷W1÷1.11=22.52×x×W2÷W3÷W1按样本细胞壁物质质量计算CLL(mg/g干重)=x×V提取×20÷W3÷1.11=22.52×x÷W31.11：是此法测得葡萄糖含量换算为CLL含量的常数，即111µg葡萄糖用蒽酮试剂显色相当于100µgCLL蒽酮试剂所显示的颜色；V提取：CLL提取液体积，1.25mL（0.5mL去离子水+0.75mL浓硫酸）；20：样本稀释倍数；W1：样本鲜重，0.3g；W2：样本细胞壁物质质量，g；W3，提取CLL时称取的细胞壁物质质量，0.01g。注意事项若样本或者干燥后的沉淀质地坚硬，可以先研碎再进行后续步骤。2.在提取CLL的过程中，首先，置于冰水浴中的EP管需要固定，不要上下左右浮动，一方面保障自身安全，另一方面防止冰水混合物进入EP管造成试验误差；再者，加入浓硫酸时，建议枪头伸入样本液面以下，缓慢加入，防止液面沸腾及样本碳化。结果展示Figure1.本试剂盒测定番茄叶片和石