Q热检疫技术规范

Q热检疫技术规范3从同批样品的不同部位共抽样5g~10g,装人无菌采样袋，密封。采集奶液于灭菌50mL.离心管中，尽量于清晨采取，采前用温热毛巾将乳房擦拭干净，用2%碘伏将乳头消毒，将头3把~4把乳汁弃去，采集后续奶液。采集的样品应在取样后4℃冷藏24h内送至实验室，应附有标签或采样单，表明采样地点、动取适量组织样品，剪碎，按1:5的比例加入灭菌的含抗生素(链霉素100μg/mL~200ng/mL和庆大霉素50mg/mL.～100mg/mL)的0.4mol/l.PBS(pH7.4),用组织研磨仪充分研磨5min~10min,制备成组织匀浆液；移人离心管，充分振荡，75℃温浴0.5h~1h;15000g清，加1mL,PBS,振荡混匀，使沉淀充分悬浮，15000g离心10min,弃上清，收集沉淀物，置于-20℃取1mL~2mL全血样品，编号，15000g离心10min,弃上清。加等体积灭菌双蒸水充分振于-20℃贮存备用。将采集的分泌物拭子和粪便拭子加入1mL灭菌的0.1mol/LPBS(pHZ.4),于振荡器上充分振荡取1g样品放入灭菌三角瓶中，加入30mL4℃预冷的0.5%TritonX-100PBS溶液，将瓶口塞心10min去除样品中大的颗粒。取上层悬液15000g离心10min,弃上清，加1mLPBS充分振荡混匀：将沉淀悬浮液移人1.5mL离心管，15000g离心10min,弃上清，收集沉淀物，置于-20℃贮存279.6质控标准阳性对照扩增出大小为686bp的特异性扩增条带，阴性对照及空白对照无扩增条带。否则，此次试验视为无效，应重新试验。9.7结果判定在试验成立的条件下，若检测样品有686bp的特异性扩增条带，则初步判定为C.Burnerii核酸阳性：被检样品无特异性扩增条带，则判定为C.Burnetii核酸阴性。检测为核酸阳性的样品，其PCR产物进行核酸序列测定，将测序结果与标准参考序列(C.1)进行比对，同源性达96.0%以上，则判为C.Barnetii核酸阳性。10实时荧光聚合酶链式反应(实时荧光PCR)10.1.2台式低温高速离心机(最大离心力12000g以上)。10.1.3Ⅱ级生物安全柜。10.1.4冰箱(2℃~8℃,-20℃、-80℃不同温度)。10.1.5微量可调移液器(10pL、100gL、200pL、1mL等不同规格)及其配套的无核酸酶处理的离心管和吸头。10.2.1试验用水应符合GB/T6682中的一级水。10.2.2组织或粪便基因组DNA提取试剂盒。10.2.3荧光PCR预混液(2×)。10.2.4空白对照(dd-O)、阴性对照(取健康动物同类样品)、阳性对照(C.Brrneri核酸或阳性质粒)。10.3引物探针序列GGGCTGCGTG-3',下游引物Cox-R:S-cccCG5'-FAM-AGCGAACCATTGGTATCGGACGTTTATGCG-Eelipse-3',预期扩增片段长度为295bp(具体序列见C.2)。方法同9.4。10.5.1荧光PCR反应体系进行荧光PCR反应体系配置，检测C.Barnetii的荧光PCR反应体系见表2。阳性、阴性和空白对照的设置同9.5.1。加入模板后充分混匀，瞬时离心，使液体沉至PCR管底。荧光PCR预混液(2×)212.1.2.310倍浓度的稀释液(吐温/PBS液)。湿盒内放37℃培养箱中感作60min,再放置4℃冰箱内过夜。12.2.2洗板：弃去板中包被液，加洗涤液洗板，每孔300gL,洗涤3次，每次1min,在吸水纸上轻轻12.2.5将血清样品(包括对照血清)稀释至适当浓度(通常为1/100),每孔滴加100pL,每个样品加112.2.12加终止波100mL终止氧化物酶反应。阳性对照平均OD值和阴性对照平均OD值(OD_/OD)的比值大于3。计算待测血清以及阳性和阴性对照血清的平均吸光值[待检血清平均OD值(OD)、阳性血清平均当S/P<30%,判为抗体阴性；当S/P在30%~40%之间，判为可疑，对于可疑血清，需要重新检验，如重新检验结果仍为30%~40%之间，则判定为抗体阳性；当S/P>40%,判为抗体阳性。比例 十 比例 ++ +++ 注：“+十“为50%溶血：“十”为75%溶血：“一”为1LABCDEF0000000一一一一一一十++一一+一一一++一+0注：“十+++"为0溶血：“十++"为25%溶血：“++”为50%溶血：“十“为75%溶血7购1200000000000000000000000037℃感作30min后进行初判，然后置室温2h,水平转子离心机2000r/mim离心5min,或4℃冰箱标准阳性血清和标准阴性血清使用前用VBD做1:10稀释，56℃水浴灭活30min;待检血清使用前用VBD做1:10稀释，灭活30min(牛56℃~57℃.绵羊、山羊63℃)。按表7建立正式试验。00000000000000090000000037℃感作30min后进行初判，然后置室温2h.水平转子离心机2000r/min离心5min,或4℃冰箱++++表示90%以上排制溶血：+++表示75%以上抑制溶血：++表示50%以上抑制溶血；+表示25%以上护制溶血；一表示100%溶血。13.5.2判定标准：待检血清1:10稀释时小于50%抑制溶血，判为Q热抗体阴性，否则判为Q热抗体(规范性)MEM培养基，加人10%无C.Burnerii抗体犊牛血清(56℃30min灭活),含青霉素200IU/μL、MEM培养基，加人2%无C,Burnerii抗体胎牛血清(56℃30min灭活),含青霉素200IU/μL、链霉素200IU/pL,抽滤除菌，置4℃保B.40.01mol/LpH7.4磷酸盐媛冲液(PBS)Na,HPO₄·12H₂ONaCl加双蒸水至1000-at.调pH为7,4,121前用PBS(pH6.8)做1110稀释。称取二水乙二胺四乙酸钠1.44g,使用80mL双燕水充分溶解，使用氢氧化钠溶液调pH双燕水至100mL,室温保存。B.6.2TAE电泳缓冲液(50×)0.5mol/LEDTA溶液(pH8,0)加双蒸水至1000mL,室温保存。B.6.3TAE电泳缓冲液(1×)使用前将50×TAE电泳缓冲液做50倍稀释即可。B.6.41.5%琼脂糖凝胶称取琼脂糖1.5g,使用1×TAE电泳缓冲液100mL充分溶解，微波炉中完全融化，待冷却至NaHCO₂含1%牛白蛋白的PBS10