KTA3020-CN-Caspase-1 活性分析试剂盒（比色法）

Caspase-1活性分析试剂盒（比色法）Caspase-1活性分析试剂盒（比色法）Cat#:KTA3020 Size:20T/50T/100T Caspase-1活性分析试剂盒（比色法） 货号：KTA3020 批号：见产品标签 适用样本：动物组织、细胞 保质期：-20℃保存12个月原理半胱氨酸蛋白酶的Caspase家族已显示在凋亡中起关键作用。哺乳动物caspases可分为三个功能组：启动子半胱天冬酶（Caspase2、8、9和10），执行者半胱天冬酶（Caspase-3、6和7）和炎性半胱天冬酶（Caspase1、4、5、11和12）。Caspase-1（ICE，白介素-1β-转换酶）是哺乳动物的caspase，负责将两种炎性细胞因子白介素1β和IL-18的蛋白水解成活性细胞因子，从而引发促炎反应。它还将加德敏D裂解为活性形式，从而导致细胞凋亡。Caspase-1活性分析试剂盒（比色法）基于Caspase1水解肽底物Ac-YVAD-pNA（乙酰基-Tyr-Val-Ala-Asp对硝基苯胺），产生黄色的对硝基苯胺（pNA），pNA在405nm附近有强吸收，从而可以通过测定吸光度来检测Caspase1的活性。包装清单试剂盒组分 规格 储存条件 20T 50T 100T CellLysisBuffer 5mL 10mL 20mL 4℃ReactionBuffer(2×) 5mL 10mL 20mL 4℃Ac-YVAD-pNA(4mM) 100µL 250µL 500µL -20℃,避光保存pNA(10mM) 100µL 250µL 500µL -20℃,避光保存DTT(100×) 150µL 400µL 750µL -20℃自备耗材·酶标仪（能测405nm处的吸光度）·96孔板·低温离心机、制冰机·可调节式移液枪及枪头·去离子水、磷酸盐缓冲液(PBS)·匀浆器（如果是组织样本）试剂准备WorkingCellLysisBuffer:使用前，立即加入DTT（最终浓度：每1mLCellLysisBuffer加10µLDTT（100×）），置于冰上；4℃保存。WorkingReactionBuffer(1×):使用前，用去离子水稀释到ReactionBuffer(1×)，再加入DTT（最终浓度：每1mLReactionBuffer(1×)加10µLDTT（100×）），置于冰上；4℃保存。Ac-YVAD-pNA(4mM):即用型；使用前，置于冰上；–20℃保存。用不完的试剂-20℃避光分装保存，避免反复冻融。pNA(10mM):即用型；使用前，置于冰上；–20℃避光保存。用不完的试剂-20℃避光分装保存，避免反复冻融。DTT(100×):即用型；使用前，置于冰上；–20℃保存。用不完的试剂-20℃分装保存，避免反复冻融。Standard设置：用ReactionBuffer(1×，含DTT)将标准品pNA(10mM)稀释为200、100、50、20、10、0µM的标准溶液。样本制备 注意：我们建议使用新鲜样品。或按照“样本制备”将样品保存在-80℃。使用前，在冰上解冻，这可能会影响样品的稳定性，并且读数可能会低于预期。此试剂盒可检测蛋白水解活性。在样品制备步骤中请勿使用蛋白酶抑制剂，它可能会干扰测定。1.通过所需方法诱导细胞凋亡。同时，建议对每个Caspase1比色测定法设置不诱导的对照培养。2.对于贴壁细胞，胰蛋白酶消化收集细胞。600g，4℃离心5min，小心吸去上清液。用1mLPBS洗涤细胞2次。离心后，去除上清液。在50µLWorkingCellLysisBuffer中重悬1-5×106个细胞。3.对于悬浮细胞，600g，4℃离心5min，小心吸去上清液。用1mLPBS洗涤细胞2次。离心后，去除上清液。在50µLWorkingCellLysisBuffer中重悬1-5×106个细胞。4.对于组织，将5-20mg组织切成小块，用PBS清洗组织，加入0.1mLWorkingCellLysisBuffer，冰浴匀浆。5.裂解物冰上孵育15-20min。6.16,000g，4℃离心15min，然后将上清液转移至新试管中，置冰上待测。7.立即测定Caspase1的酶活性或-80℃保存样品。同时可以取少量样品用Bradford法测定蛋白浓度。注意：如需测定蛋白浓度，推荐使用Abbkine货号：KTD3002的蛋白质定量试剂盒（Bradford法）进行样本蛋白质浓度测定。实验步骤1.酶标仪预热30min以上，调节波长到405nm。2.操作表（下述操作在96孔板中操作）： 空白孔（μL） 标准孔（μL） 测定孔（μL）WorkingReactionBuffer(1×，含DTT) 100 50 50Standard 0 50 0上清 0 0 50Ac-YVAD-pNA(4mM) 5 5 53.混匀，37℃孵育1-2h，检测405nm处吸光值。空白孔记为A空，标准孔记为A标、测定孔记为A测。计算ΔA测=A测-A空，ΔA标=A标-A空。注意：1.空白孔只需测定1-2次。实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验；2.在反应体系中，适当混匀，注意避免在混匀时产生气泡；3.发现颜色变化比较明显时即可测定405nm的波长。如果颜色变化不明显，可以适当延长孵育时间，甚至可以孵育过夜。结果计算注意：我们为您提供的计算公式，包括推导过程计算公式和简洁计算公式。两者完全相等。建议以加粗的简洁计算公式为最终计算公式。1.按标准曲线计算以标准溶液浓度为x轴，ΔA标为y轴，绘制标准曲线y=kx+b。将样本的ΔA测带入方程得到x值（μM）。2.按酶活性增加百分比计算Caspase1活性增加百分比=(实验处理组A测定-A空白)/(实验对照组A测定-A空白)×100%该方法简单可靠，可粗略反应酶活性情况。3.按酶活计算参考Chemicon公司的Caspase酶活力单位的定义：Oneunitistheamountofenzymethatwillcleave1.0nmolofthecolorimetricpNA-substrateperhourat37℃undersaturatedsubstrateconcentrations。即一个酶活力单位定义为当底物饱和时,在37℃一个小时内可以剪切1nmolpNA底物产生1nmol游离pNA的酶量。这样就可以计算出样品中含有多少个酶活力单位的caspase酶活性。Caspase1活性（U/mgprot）=x×V反总÷(V样×Cpr)÷T×103=2.1×x÷Cpr÷TV反总：反应体系总体积，0.105mL=1.05×10-4L；V样：加入的样本体积，0.05mL；T：反应时间，h；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；103：单位换算系数，1μmol=103nmol。注意：对于样品中Caspase1酶活力特别高的情况，须用WorkingCellLysisBuffer适当稀释样品后再进行测定。计算时再乘以稀释的稀释倍数n。结果展示典型标准曲线--以下数据和曲线仅供参考，实验者需根据自己的实验建立标准曲线。[p