2023 年外泌体行业研究报告

以下文章来源于维渡纵横，作者郭允乐贾心语2013年，三位“外泌体“领域的科学家荣获“诺贝尔奖”，这也让“外泌体”这个名词进入大众视角，这是一种30-150nm的纳米级的脂质结构，自身对抗衰、修复、抑制炎症、美容等都具有非常显著的功效，并且它的穿透性极强、吸图1.2013年诺贝尔生理或医学奖-外泌体本研究报告在维渡纵横发布的2022年研究报告基础上，更加系统、深入、多角度的对外泌体/细胞外囊泡领域进行1外泌体行业概述递送系统的演变随着治疗方式从“小分子”扩展到包括“核酸”、“多肽”、“蛋白质”、“抗体”、“核图2.治疗方式的演变现代药物递送技术始于1952年，诞生了Spansule（缓释胶囊）技术，到20时间，并主导了药物递送领域和市场；1989年，基于LupronDepot（PLGA聚合物）的批准为长效注射剂和植入剂打开了大门，并出现递送各种小分子、多肽、蛋白质的系统的百花争艳；1990年第一个Adagen（PEG化蛋白）的二醇化蛋白药物，该技术从1995年的Doxil（PEG化脂质体）批准开始在纳米制剂中应用，在2018年批准了siRNA药物如Onpattro（PEG化LNP）、2021年批准了mRNA药物如Comiranty（PEG化LNP）。2000年，美国政府推出了“国家纳米技术倡议”(NNI)，被称为“纳米医学”，Mylotarg（ADC）、Doxil（PEG化脂质体）、Abraxane（白蛋白-紫杉醇复合物）成为纳米医学的典型代表；药物-聚合物复合物和偶联物中的ADC至今备受关注，2009年第一个抗体-药物偶联物Mylotarg（ADC）获批；2018年Onpattro（LNP）的获批打开了LNP递送系统的广泛应用，众多创业公2017年首个眼科AAV基因递送药物Luxturna（AAV）上市，AAV等病毒递送系统进入了爆发期；2021年，exoIL-12(Exosome，外泌体）率先进入人体临床试验，标志着外泌体递送系统进入了产业化的征途。虽然该产品由于某些原因暂停，但后起之秀ExoFlo™（Exosome,外泌体）学和细胞与基因治疗的新篇章。图3.递送系统的演变外泌体递送系统不同于传统递送系统，包含天然外泌体和工程化外泌体：天然外泌体内部包裹了多种调节蛋白、microRNA和mRNA等天然活性物质，具有优异的治疗和美容效果，作为细胞治疗的“无细胞疗法”的重要手段。1）在医美护肤领域：ExoCoBio的干细胞外泌体已经于2018年上市销售，是世界首创将源于干细胞培养液的外泌体（ASC-EXOSOME™)成分冷冻干规模销售。2）在治疗药物领域：干细胞天然外泌体药物ExoFlo™中发现了多种蛋白和核酸物质，可替代干细胞治疗，处于美国III期临床试验；CAR-T细胞来源的EVs表达高水平的穿孔素和颗粒酶B以及CAR，有效地杀伤实体肿瘤。表1外泌体药物ExoFlo™中发现的调节蛋白工程化外泌体是通过“基因工程”或“化学工程”对外泌体进行工程化改现活性物质的靶向递送，可广泛递送小分子、多肽、蛋白、抗体、核酸等活性物质，具有增强的载药效率、靶向性、抵抗机体清除率等特点。工程化外工程化外泌体代表企业Codiak由于产品开发失利而宣告破产发具有一定挑战性。外泌体结构及形成外泌体（Exosome）是几乎所有细胞均可释放的、直径约30-150nm的细胞外囊泡（Extracellularvesicle,EV），由细胞内多泡体（multivesicularbody，MVB）与细胞膜融合后，释放到细胞外基质中。EV可分为Exosome（外泌体,30-150nm）、Ectosome（核外颗粒体,100-1000nm）、Apoptoticbodies（凋亡小体,50-5000nm）三大类。Exosome由胞吐作用（exocytosis）释放，Ectosome由质膜向外出芽（Outwardbudding）而分泌，Apoptoticbodies在凋亡后期由程序性死亡图4.细胞外囊泡亚型示意图；(Int.J.Mol.Sci.2016,17,170)在经典分泌途径中，带有蛋白质货物如胞外蛋白的囊泡在高尔基体（GOLGI）），囊泡（核外颗粒体,Ectosome）方式运输到细胞外空间。货物通过细胞内吞），外泌体（Exosome）的形成始于初级内体（EE）的膜向内出芽，泡体（MVBs）。在胞吐途径①中，多泡体（MVBs）与质膜（PM）融合，将其内容物（外泌体，Exosomes）释放到细胞外空间，外泌体货物运送到受体细胞可以通过直接与受体细胞膜融合（Membranefusion胞饮作用/吞噬作用（Pino-orphagocytosis或配体-受体结合（Receptorbinding）等各种机制发生；在降解途径②中，多泡体（MVBs）行酶辅助降解。这一途径对于抑制激活的生长因子受体的信号传导尤为重要图5.不同类型EV形成通路Extracellularprotein-胞外蛋白；Receptor-受体；Cargo-货物:蛋白、RNA等；Regularproteinexport/secretion-调控蛋白运输/分泌；Intraluminalvesicle(ILVs)-腔内小囊泡；Exosome-外泌体；Shedvesicle/Ectosome-核外颗粒体；PM-质膜；ER-内质网；EE-初级内体；LE-次级内体；LS-溶酶体；MVB-多泡体；GOLGI-高尔基体；NUCLEUS-细胞核；Exocyticpathway-胞吐途径；Degradativepathway-降解途径；(Int.J.Mol.Sci.2016,17,170)在外泌体的生成过程中，有几种蛋白密切参与，包括RabGTPases、ESCRT蛋白，以及被用作外泌体标记的CD9、CD81、CD63、flotilin、TSG101、神经酰胺和Alix等。不同来源的细胞生成外泌体的速率、大小、组分(货物)均有异质性。外泌体腔内组分主要由mRNA、miRNA、gDNA片段、以及无数图6.外泌体的组分和鉴定外泌体作为细胞间物质交流和信号传递的途径，不同细胞间通过分泌携带有不同组分的外泌体实现通讯，这些分泌的外泌体被受体细胞吸收，通过释放天然外泌体使用不同细胞来源产生的“天然外泌体”已经在医美领域实现商业化，同步也正在进行多项药物临床试验，最快已处于临床III期试验，显示出不错的安全性和有效性。布局天然外泌体的代表企业包括ExoCoBio、天津外泌体科技、佰傲医学、DirectBiologics等，这些企业将是外泌体行业最先商业化的企业。1983年，Pan和Johnstone在研究网织红细胞成熟到红细胞过程的研究里，在体外培养的绵羊红细胞培养液上清液中发现了一种从网织红细胞释放的囊年，Raposo等发现B淋巴细胞分泌的外泌体携带MHC-Ⅱ类分子、共刺激因子和黏附因子。2007年，Lotvall和Valadi发现细胞之间可以通过外泌体中的RNA来交换遗传物质。2013年，诺贝尔生理或医学奖授予从事细胞内囊泡(外泌体)运输调控机制研究的3位科学家——JamesE.Rothman、RandyW.Schekman和ThomasC.Südhof，由此将外泌体研究推向了前所未有的新高潮。图7.细胞分泌外泌体图示几乎所有类型的细胞，都可以产生并释放外泌体。根据不同生物来源分类，外泌体分为动物细胞外泌体、植物外泌体、微生物外泌体。（1）动物细胞外泌体哺乳动物细胞外泌体由几乎所有类型的“健康于不同的体液中，例如血浆、尿液、乳汁、唾液、羊膜、细支气管肺泡、滑膜以及腹水等。在循环外泌体中，80-90%来自血小板、淋巴细胞、树突状细胞、其他免疫细胞，通过循环系统到达其他细胞与组织产生远程调控作用。正是基于此，外泌体天然具有活性物质的递送功能（天然递送系统）和作为疾病的特异性生物标记物（诊断标志物）。图8.哺乳动物细胞外泌体人心脏祖细胞外泌体、骨髓间充质干细胞外泌体、脂肪干细胞外泌体、树突状细胞外泌体、HEK293细胞外泌体。图9.处于临床的外泌体种类和GMP生产TzuChiMedicalJournal2020,32,113-120）（2）植物外泌体植物外泌体（plantexosome）的形成区域通常始于反式高尔基体或者早期内体，随后形成多囊泡内体（MVEs）或者多泡体（MVBS），并选择性地将mRNA、miRNA、其他非编码RNA等多种RNA、脂质、DNA等结合进囊泡中，最终植物外泌体与质膜结合将内含物释放。植物外泌体体积小、组织穿透性强，在不同的酸碱度和温度下都能维持较好的理化稳定性，成为经皮递送、靶向给药、基因传递等递送理想载体。目前，公开报道的植物外泌体研究包括葡萄外泌体、生姜外泌体、芦荟外泌体、人参外泌体、金银花外泌体、甘草外泌体、红景天外泌体、西兰花外泌体、葡萄柚外泌体、小麦外泌体、大蒜外泌体、蒲公英外泌体、洋葱外泌体等。研究发现，植物外泌体蕴含了植物中90%的活性成分，是植物有效成分浓缩的精华中的精华。1kg植物仅能提取1μg植物外泌体，而其活性却远高于1kg植物提取物。图10.植物外泌体或衍生的PELNV的生物功能MolecularTherapy.2021,29,13-31）植物外泌体含有较为丰富的miRNA，为一类长度约为22个核苷酸的内源单链非编码RNA，来自药用植物外泌体的miRNA可能作为新的生物活性成分与哺乳动物系统相互作用，外泌体作为中药活性成分的应用将越来越广泛。（3）微生物外泌体微生物外泌体的研究主要集中在细菌胞外囊泡(BEVs)，其发现可追溯到20世纪60年代。BEVs类型多种多样，根据产生方式不同包括：菌来源的外膜囊泡（outermembranevesicles，OMVs）、古菌和革兰氏阳性细菌来源的细胞质膜囊泡（cytoplasmicmembranevesicles，CMVs）、外-内膜囊泡（outer-innermembranevesicles，OIMVs）、破裂性外膜囊泡(explosiveoutermembranevesicles，EOMVs）。图11.不同的途径导致形成不同的膜囊泡类型NatRevMicrobiol.2019,17(1):13-24.）BEVs直径范围为20-400nm，影响多种生物过程，包括毒力因子的运输、谢物输出、细胞间通讯等。极促进肠道和远端器官的基本功能。在肠道生态系统中，微生物群与宿主之间的双向通讯不涉及直接的细胞接触。越来越多的证据表明，细菌分泌的BEVs通过向宿主细胞运输和传递调节宿主信号通路和细胞过程的效应分子来介导菌群功能，肠道微生物群释放的BEVs可能对健康和疾病有很大的影响。微生物群组成和多样性的失衡与包括癌症、神经、代谢种疾病有关，在患者和健康人群的血液和尿液样本中发现了肠道微生物群来工程化外泌体为了拓展其作为纳米递送系统的可能性，科学家通过生物工程、化学工程策略来设计并装载“工程化外泌体”，开发出了基于工程化外泌体的“纳米递送系统”。生物工程（BiologicalEngineering）通过膜结合蛋白的遗传融合引入靶向基序，如多肽、蛋白、ASO等，代表企业有Codiak、Evox、唯思尔康、恩泽康泰等。化学工程（ChemicalEngineering）指通过“脂类化学反应”或“膜适配体、小分子、聚合物等，代表企业有天津外泌体科技等。图12.工程化外泌体的表面修饰方式根据外泌体纯化前还是纯化后进行装载分为三种装载方式：内源装载(Endogenousloading)：对来源细胞进行生物工程改造，使其分泌工程化外泌体，也称Preproduction；外源装载(Exogenousloading)：先分离纯化好高纯度外泌体，进行负载改造，也称Postproduction；Perproduction：在外泌体形成过程中，利用物理方法破坏-再造质膜而封装图13.工程化外泌体的装载方式AdvancedDrugDeliveryReviews.2021,178:113972.）（1）内源装载内源装载(Endogenousloading)是在分泌外泌体的细胞上做基因工程改造，让其产生携带目标分子的外泌体。例如，构建融合表达特定蛋白和外泌体膜蛋白的质粒，通过转染等方式，让该融合蛋白在外泌体来源细胞中大量表达，分子，都可以采用内源装载。不过，与外源装载相比，内源装载的实验难度更大、周期更长。图14.内源装载方式；(CritRevBiotechnol.2020,40(6):804-820.)（2）外源装载外源装载(Exogenousloading)的常用方法有孵育、超声透化、电穿孔、脂孵育是让待装载的分子与外泌体在一定条件下充分接触，依靠外泌体膜本身的疏水性被动完成装载。孵育法操作简单，不会破坏外泌体膜的完整性，主要适用于疏水小分子，装载效率受药物浓度影响，所需时间较长。电穿孔是通过外加电场，在外泌体膜上形成临时的亲水性孔道，增加外泌体膜的通透性，使小分子物质能够穿过孔道进入外泌体内部。主要适用于装载亲水分子，过量投入外泌体有助于提高回外泌体膜的稳定性，也可能导致核酸药物本身聚集导致假阳性结果。超声是利用探针超声仪对外泌体进行超声处理，使外泌体膜变形，产生瞬态小孔，增加膜的通透性，从而小分子物质扩散到外泌体中。主要用于装载亲水分子，装载后有些小分子物质也会附着于外泌体膜外侧。装载效率高于电穿孔和孵育，但对外泌体膜的损伤较大，可能导致外泌体破裂且实验重复性较差。脂质体融合外泌体是实现活性物质直接装载的一种有希望的替代方法。为了控制和改变外泌体纳米载体的生物功能，京都大学Katsura通过用冻融技术融合脂质体和外泌体的质膜从而得到杂交的外泌体。特定遗传修饰细胞分泌的外泌体与各种脂质体融合，是非常有效的膜工程方法。如Lipofectamine含有脂质亚基，可在水环境中形成脂质体并捕获核酸，带正电的脂质体表面与带负电的外泌体质膜融合，随后释放核酸完成杂交外泌体的装载。也有研究单位利用穿膜肽（CPP）转染核酸药物到外泌体中，快速简便且高效。维渡纵横认为，脂质体融合外泌体技术与LNP的四组分原理有着异曲同工之妙，为mRNA和siRNA药物的发展提供了更广阔的空间。图15.脂质体融合外泌体；(SciRep.2016,25:21933.)化学偶联外泌体是最具商业化潜力的新兴技术，通过“脂类化学反应”或“膜蛋分子、聚合物，在外泌体上进行可控、可调节的多功能化改造。化学偶联技术可控制功能化分子在外泌体上的“值得注意的是，外泌体偶联药物（EDC）的高效Payload装载，突破了抗体偶联药物(ADC)载药率低、安全性有限的瓶颈。根据维渡纵横统计，天津外泌的公司，根据已发表文章显示其药物装载率装载Herceptin抗体的外泌体呈现靶向效果相比对照组提升174.5倍。图16.外泌体化学偶联技术外泌体的功能不同的细胞通过分泌携带不同组分的外泌体实现细胞间通讯，这些外泌体被受体细胞吸收，通过物质交换或释放内含物实现物质和信号的交流。外泌体与受体细胞的信息交流可能通过以下四种途径实现：1）外泌体表面膜摄入外泌体。经由以上几种途径，外泌体将其携带的生物信息运输到靶细胞或经体液运输而被远端组织细胞摄取，进而影响目的细胞的基本功能和基因表达，这些外泌体参与了一系列生理和病理过程，如繁殖和发育、抗原呈递、免疫调节、组织愈合、感染、代谢和心血管疾病、神经退行性疾病、癌症发生发展等。2外泌体的商业应用外泌体在美容抗衰、药物治疗、递送载体、体外诊断和科研试剂方面有着广阔的应用前景，其中美容护肤抗衰产品已率先实现了商业化。本章将详细阐医疗美容与护肤、体外诊断早筛的商业化应用。天然外泌体疗法干细胞由于其旁分泌机制发挥治疗作用成为再生应用中最流行的外泌体细胞源。间充质干细胞、胚胎诱导的多能干细胞、组织特异性干细胞、初级前体和成熟细胞等分泌的外泌体都有案例成功应用于再生治疗中。同时，科学家也发现免疫细胞来源和肿瘤细胞来源的外泌体可用于肿瘤免疫治疗和开发肿瘤疫苗。表2.天然外泌体疗法全球临床进展（1）肺部感染和ARDS治疗2021年3月，美国FDA批准DirectBiologics公司的干细胞外泌体药物ExoFlo™的IND申请，顺利进入临床I/II期试验。它是从人骨髓间充质干细至重度新型冠状病毒感染和急性呼吸窘迫综合征(ARDS)。根据DirectBiologics公司披露，ExoFlo™的II期临床没有出现不良事件(AE)和重大不良事件(SAE)；ExoFlo-15ml组的死亡率具有统计学意义上的降低，与安慰剂组相比，在18-65岁的呼吸衰竭患者中，绝对和相对风险分别降低了30.8%和61.6%；在18-65岁的ARDS患者中，死亡的绝对风险和相对风险分别降低了41.9%和57.7%。2022年7月，ExoFlo™进入临床III期试验，2023年1月，ExoFlo™完成了于疾病治疗的重大里程碑。ExoFlo™除了新冠感染治疗和ARDS适应症外，其他适应症包括克罗恩病、肠易激综合征、溃疡性结肠炎、器官移植排斥、DirectBiologics公司认为ExoFlo™的成功源自公司的cGMP放大工艺和无菌工艺获得了超纯无菌外泌体；每毫升可提供超过100亿个外泌体带来了优异的功效；完美的质量控制使每一瓶外泌体都具有质量一致性。图17.ExoFlo产品西比曼的haMPC-Exos用于肺部感染处于IIT研究，入组了60例志愿者，正在瑞金医院开展（NCT04544215）。肺损伤相关实验研究表明，干细胞外泌体具有积极的治疗作用。VittiLabs的外泌体药物EV-Pure用于治疗肺纤维化和女性生殖障碍/原发性卵巢功能不全适应症已经于2022年10月进入临床I期（NCT05387239）。（2）心血管疾病治疗干细胞外泌体的心脏保护机制已成为研究热点，越来越多的研究证实，干细胞外泌体具有与干细胞相似的心脏保护功能，能显著提高心肌细胞的存活率、抗心肌细胞损伤、促进新生血管形成、改善心脏功能、抗炎、抗心肌细胞凋亡、促进心肌细胞再生。外泌体具有变以及免疫排斥反应，有望成为治疗心血管疾病的有效方法。间充质干细胞外泌体在治疗心血管疾病如心肌梗死和心力衰竭方面具有巨大的潜力。《StemCellsjournals》发表了相关综述，讨论了间充质干细胞外泌体促血管生成、增强其生物活性改善心脏组织修复的方法。2022TehranUniversityofMedicalSciences发起的MitochondriaandMSC-derivedexosomes用于治疗心肌梗塞的临床试验正式开展，入组了20例志愿者来评估疗效（NCT05669144）。间充质干细胞外泌体在缺血性心脏病中具有很好的疗效。发表在《BioMed模型大鼠的心脏的纤维化和炎症反应，并且明显改善了心脏的功能。9月，伊斯法罕医科大学的最新临床研究（NCT03384433）通过5例患者探索了携带miR-124的间充质干细胞外泌体对缺血性心脏病的临床治疗作用。（3）肝肾损伤治疗肝脏疾病相关实验研究表明，干细胞外证明干细胞外泌体通过激活SPhks和s1p信号通路保护肝脏免受肝缺血/再上皮间充质细胞的转移和胶原蛋白的生成来改善肝纤维化。肾损伤相关实验研究表明，外泌体中携带的miRNA和蛋白能够减轻ILIASBiologics公司的外泌体药物ILB-202进入了临床I期，靶向NF-κB用于治疗急性肾损伤。图18.ILB-202机制（4）眼科治疗外泌体可在泪液、房水、玻璃体液、血液等眼部体液中稳定存在，在调节眼部细胞迁移、增生、凋亡、免疫反应、血管生成等方面发挥重要作用，与角膜损伤、糖尿病视网膜病变、年龄相关性白内障、青光眼、年龄相关性黄斑变性、葡萄膜黑色素瘤等眼病关系密切。ErciyesUniversity的治疗产品Whartonjellyderivedmesenchymalstemcellexosomes处于II/III期临床（NCT05413148），用于治疗视网膜色素变性。该研究于2022年8月开始，入组135例志愿者。原生生物的间充质干细胞外泌体PSC-MSC-Exo处于IIT研究，用于治疗干眼眼症。（5）肿瘤治疗肿瘤细胞来源的外泌体通常包含一些肿瘤抗原，可以使抗原递呈细胞激活，故而外泌体可用于肿瘤疫苗的开发，且一些研究发现此类肿瘤疫苗具有很好的可行性和安全性。医药魔方数据显示，复旦张江的Chimericexosomaltumorvaccine（嵌合外泌体肿瘤疫苗）目前处于临床I期研究，用于治疗膀胱癌。图19.外泌体在肿瘤免疫中的功能免疫细胞来源的外泌体能够介导和调节机体对肿瘤的免疫反应，外泌体在肿大量的MHC-多肽复合物和免疫刺激相关的分子，能够激活相关的T细胞，介导体内抗肿瘤应答，在多个临床试验中表现出良好的抗肿瘤疗效。CAR-T细胞来源的EVs表达高水平的穿孔素和颗粒酶B以及CAR，诱导表效地穿透实体肿瘤，该文章CAR-T-DerivedExtracellularVesicles:APromisingDevelopmentofCAR-TAnti-TumorTherapy发表于《Cancer》（Cancers2023,15(4),1052）。图20.T淋巴细胞衍生的细胞外囊泡参与免疫反应（6）软骨损伤治疗骨关节炎是临床常见病，以关节软骨损伤、软骨下骨硬化、滑膜炎症等为特征。近年来大量研究表明，干细胞外泌体具有抗炎、免疫调节、促进组织修复和再生等作用，是治疗骨关节炎和软骨损伤的新疗法，不同干细胞来源的外泌体对骨关节炎均能起到保护和治疗的作用。SF-MSC-EX用于治疗软骨损伤处于临床II期试验阶段（NCT05261360），该试验于2022年3月开展，入组受试者30例。CellsforCells的CelliStemOA-sEV处于临床I期，用于治疗膝骨关节炎。四川大学华西医院的AutologousAdMSC-Exo治疗骨关节炎已开展IIT研究。（7）其他治疗干细胞外泌体可以用于治疗脑卒中、糖尿病、卵巢早衰、克罗恩病、肠易激、皮肤相关疾病、移植物抗宿主病、伤口愈合等疾病。工程化外泌体递送外泌体的作用不断被发掘，广泛作为药物、医美护肤、疫苗的递送载体。外一经发现就备受学术界和工业界关注。程化外泌体，装载递送蛋白类、核酸类、多肽类分子实现创新药和疫苗（1提高患者用药效率、降低用药频率、联合用药提升治疗效果、减少全身暴露工程化外泌体药物进入临床试验，1个处于IIT研究（表3）。表3.工程化外泌体全球临床进展（1）装载蛋白CovenD24（也称EXO-CD24）由OBCTCD24Ltd和ElpenPharmaceuticalCo.Inc.联合研制，用于抗新冠肺炎，共计开展了一个临床I期试验和4个临床II期试验（NCT04969172、EudraCT2021-002184-22、EudraCT2021-004259-17、NCT04902183、NCT04747574），先后共入组了526例志愿者，取得积极成果，超过90%的参与试验的新冠重症患者在5天内治愈出院。CovenD24是一种以外泌体为载体、内含CD24蛋白的药物，CD24主要通过与特定细胞受体结合，能够抑制免疫反应及细胞因子释放，抵抗COVID-19。但目前CD24这一靶点尚无新药获批，默沙东以4.25亿美元预付款收购的CD24-Fc融合蛋白药物（MK-7110）终止了新冠肺炎的临床III期试验，实体瘤适应症正在开展临床I/II期试验。所以CovenD24选择CD24或具有较大研发风险。图21.CD24/Siglec-10信号通路CD24与巨噬细胞上的Siglec-10互相作用，可抑制巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬，敲除CD24或Siglec-10，将促进巨噬细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。CD24被认为是一种新型肿瘤免疫靶点，与明星分子CD47一样，也是一种肿瘤细胞“别吃我”信号蛋白。exoIL-12™和exoSTING™由CodiakBioSciences研发，是基于该公司工程化外泌体技术平台engEx™PLATFORM开发的两款产品，也是全球最先进入临床的工程化外泌体递送药物。该平台使用PTGFRN和BASP1作为支架蛋白，将靶向配体或治疗分子安装到BASP1蛋白上，达到运输至靶组织靶细胞和治疗疾病的作用。图22.engEx™PLATFORM外泌体递送平台exoIL-12™是一种外泌体治疗候选药物，通过外泌体支架蛋白PTGRFN在表引起严重不良事件，导致多个临床试验失败，特别是在刚刚过去的2022年，所以Codiak在外泌体全新领域再叠加风险极高的IL-12或将带来较大的研发风险。小贴士：白介素临床失败案例2009年11月，罗氏的重组IL-12（Ro24-7472）宣告II期临床试验失败；2022年3月，BMS与Nektar合作开发的IL-2受体激动剂NKTR-214联合Opdivo治疗黑色素瘤的III期临床试验宣告失败；2022年8月，Moderna停止开发靶向IL-2的治疗自身免疫性疾病的mRNA药物mRNA6231；2022年8月，Codiak宣布暂停推进exoIL-12™的II期临床试验，具体原因未披露；2022年9月，红细胞治疗先驱Rubius首发的两个产品RTX-224（IL12/4-1BBL）、RTX-240（IL15/4-1BBL）也是触碰了白介素的魔咒宣告I期临床试验失败并破产清算；2022年10月，赛诺菲宣布终止偏向性IL2疗法SAR444245的II期临床试验；2022年11月，IL-2/IL-15激动剂NL-201宣布临床I期失败，Neoleukin公司裁员70%；2023年1月，默克转让IL-12类似物M9241给PDSBiotechnology。该分子于2011年进入临床I期，至今已开发12年，仍处于临床II期试验，可见白介素类产品开发的难度之大；2023年2月，阿斯利康放弃IL-12产品MEDI9253的推进。exoIL-12™适应症为皮肤T细胞淋巴瘤（CTCL给药途径为瘤内注射。2020出良好的安全性和耐受性，没有局部或系统治疗相关的不良事件，也没有检测到IL-12的全身性暴露。2022年6月，Codiak公布CTCL试验部分，2例患者均得到治疗，每位患者在多个肿瘤病变处接受了20余次exoIL-12注射（6.0μg治疗时间大于6疾病负担减少61%，注射和未注射的所有皮肤病变CAILS评分的改善范围为20-80%，治疗医生认为不需要再注射。患者002注射了20次，疾病负担降低了43%，注射和未注射的所有病变的CAILS评分均有30-50%的改善。披露数据结果的同时宣布将于2023年第一季度启动II期试验，但2022年8月公司突然公告暂停exoIL-12™的临床II期，具体原因未披露。图23.exoIL-12™的结构exoSTING™是将STING激动剂纳入外泌体腔内，同时在外泌体表面表达高水平的PTGFRN蛋白，以促进肿瘤抗原提呈细胞的特异性皮肤鳞状细胞癌，2022年9月完成27例志愿者参与的临床I/II期试验。在所有剂量队列中，exoSTING耐受性良好，未观察到三级或更高级别的剂事件(TRSAE)——2例二级细胞因子释放综合征、1例一级发热。在注射肿瘤和远端非注射肿瘤中观察到抗肿瘤活性的迹象。数据支持将exoSTING推进划2023年第一季度启动临床II期试验，但2022年8月公司突然公告暂停exoSTING™项目。图24.exoSTING™的结构（2）装载核酸exoASO™-STAT6是在外泌体表面装载了针对STAT6转录因子的反义寡核苷酸(ASO)，同时在外泌体表面表达高水平的PTGFRN蛋白以促进选择性靶向M2极化肿瘤相关巨噬细胞的摄取。该产品适应症为晚期肝细胞癌(HCC)、胃图25.exoASO™-STAT6的结构（3）装载小分子将小分子药物装载于外泌体有利于提高药物的稳定性、溶解度、生物利用度、也可以装载在外泌体表面，但需要筛选一些适合装载的小分子，方法有共孵育、挤压、超声、反复冻融、微流控、供体细胞共培养和再分泌以及下文提到的外泌体偶联药物。等分子，表现出优异的效果，为后续新药的开发奠定了坚实基础。图26.牛奶外泌体-阿霉素的内部装载；（JournalofExtracellularVesicle,2021,10(13):e12163）（4）口服给药牛奶是外泌体的可扩展来源，含有来自多种细胞来源的丰富外泌体，已经证明牛奶外泌体(MEs)是进化上保守的细胞外囊泡(EV)，具有良好的稳定性和低免疫原性，显示出优异的跨物种耐受性。牛奶外泌体可以在胃中的强酸性条件和肠道中的降解条件下存活，保持结构环系统后发挥作用。牛奶外泌体穿越胃肠道屏障的能的口服给药工具，已被广泛接受为运输多种生物分子和化疗药物的有前途的口服药物载体。2023年3月11日，天津外泌体科技（TingoExosomesTechnologyCo.,Ltd）开发出mRNA-牛奶外泌体新型口服递送系统，相关研究成果于发表于《Vaccines》。牛奶外泌体能够保护mRNA免受消化道酶和pH值变化等因素影响，基于这些特性，天津外泌体科技研发团队开发出高效mRNA-牛奶外泌体新型口服疫苗，初步实现SARS-CoV-2RBDmRNA的口服递送。图27.mRNA-牛奶外泌体新型口服疫苗；（Vaccines2023,11(3),673）外泌体偶联药物2021年7月26日，Nature子刊NatureBiomedicalEngineering在线刊发了中科院魏炜教授团队联合首都医团队共同署名文章，开发出外泌体偶联VEGF单抗，利用Treg来源的外泌体(rEXS)为载体，通过基质金属蛋白酶(MMP)敏感肽段(cL)连接VEGF抗体(aV)，创建了rEXS-cL-aV体系。当玻璃体腔注射后，利用rEXS向炎症部位的趋化性，携带aV富集于眼底新生血管病灶，随后利用病灶部位高表达的MMP酶解敏感肽段cL并释放aV，在小鼠模型中证明其VEGF单抗，具备强大的市场潜力。图28.外泌体偶联VEGF单抗；(NatBiomedEng.2021,5(9):968-982)（Exosome-XenobioticConjugation）已经实现Her2抗体负载的外泌体靶向除了偶联抗体，天津外泌体科技使用小分子青蒿琥酯作为模型药物，实现了子，实现了毫克级药物装载。该公司利用EXC平台设计并制备了首个EDC（Exosome-DrugConjugation）模板药物，外泌体表面化学偶联抗体和小分子，突破ADC药物载药率低、安全性有限的瓶颈。图29.EDC相对ADC的潜在优势医疗美容与护肤激活细胞再生功能，渗入皮肤后释放囊泡包裹的营养物质，持续滋养，调整细胞微环境，增强细胞活力，进而促进细胞迁移，促进胶原蛋白及弹性修复损伤、细胞再生，恢复皮肤年轻态，在医疗美容与护肤品领域的应用非常有潜力。韩国ExoCoBio（ASCE+™、EXOMAGE™和CELLTWEET™)、佰傲医学捍马医疗（奥本源）、天津外泌体科技（牛奶外泌体原料+Y3）、娇韵诗（光图30ExoCoBio外泌体美容护肤品的机制（1）皮肤修复2019年，ExoCoBio在StemCellResearchandTherapy上发表了一篇科学靶点，促进伤口愈合，在世界上属首次系统化的报道。研究表明，干细胞具有旁分泌的特性，能够修复损伤组织、促进细胞生长及调节免疫反应，其分泌的外泌体作为细胞分泌的关键一环，可以通过大部分毛细血管到达远处损伤部位，并且可以与现有已知活性药物进行组合，增强疗效，促进炎症消除和伤口愈合。“ASCEplus-SRLV”是世界首创将源于干细胞培养液的外泌体（ASC-EXOSOME™)成分冷冻干燥制成的产品，以具卓越的“肌肤再生”及“抗的粉末安瓶及液态安瓶，使用时将两种安瓶混合后使用。ASCEplus外泌体可以减少55%的炎性细胞因子，促进7倍的胶原蛋白合成，以及增加3倍的弹性蛋白合成，达到皮肤修复再生、延缓衰老、改善痘肌、炎症等作用，从而全方面改善皮肤问题。2021年6月，ExoCoBio公司与biobijou公司合作进入中国市场。图31.美容产品ASCE+2021年3月，梅奥诊所开展了一项《APhaseIOpen-LabelTrialtoDeterminetheSafetyofPEPonaSkinGraftDonorSiteWound》研究，入组了37例受试者，确定一种被称为PEP（一种源自美国人的聚集的生物制剂在有皮肤移植供体伤口的人中的安全性（NCT04664738）。（2）延缓衰老2019年，美国约翰霍普金斯大学科研团队研究发现，高度纯化的诱导多能干细胞来源的外泌体（iPSCS-EXO）用于培养活性氧（ROS）水平升高的衰老此，来自人类干细胞的外泌体可以缓解干细胞在培养中的老化（StemCells.2019,37(6):779-790.）。2020年7月7日，英国伦敦玛丽皇后大学AnaO’Loghlen团队在《CellMetabolism》（IF=21.567）发表了“SmallExtracellularVesiclesHaveGSTActivityandAmeliorateSenescence-RelatedTissueDamage”。研究指出，胞的衰老，揭示了外泌体通过自身GST活性调节GSH/GSSG而影响细胞和器官的ROS积累，从而调控衰老表型。近期，该研究在《NatureReviewsMolecularCellBiology》杂志（IF=55.47）上进行了Highlight推荐（CellMetab.2020,32(1):71-86.）。2022年，ScienceAdvances杂志上发表一篇文章，用来自年轻动物的脂肪间充质干细胞(ADSC)的小细胞外囊泡(sEV)治疗老年动物，发现通常随着衰老而改变的几个参数有所改善，例如运动协调性、握力、抗疲劳性、毛皮再生、肾功能、虚弱（SciAdv.2022,8(42):eabq2226）。图32.外泌体的抗皮肤衰老作用（3）敏感肌修复据中山大学附属第三医院皮肤科副主任郑跃介绍，该院皮肤科从2020年10月开始到2021年7月完成了一项临床试验，招募了44例不同类型皮肤敏感的患者，用涂抹式的外泌体舒缓修复敏感性皮肤。临床研究初步显示，外泌体对皮肤屏障有较好的修复作用，它对敏感性皮肤，特别是有红斑或者是有红区炎症的敏感性皮肤有较好的治疗效果，也就是反映了外泌体的抗炎作用。郑跃表示，临床试验结果认为，外泌体作为皮肤修复的手段之一，可以单独使用或根据皮肤状态和需求联合功效性护肤品、玻尿酸、光电等其他医美手段一同使用。中山大学附属第三医院皮肤科主任赖维认为：外泌体免疫原性低，还含有抗炎成分等，除了修复敏感肌，还有抗衰老和皮肤美容的功能，可以满足敏感肌和衰老肌肤的修复、抗炎、舒缓及皮肤活力再生。在科罗拉多州丹佛市举行的2022年美国皮肤外科学会（ASDS）上，梅奥诊所的SaranyaWyles医学博士团队公布一项外泌体美容研究，招募了56名善。特别是40多岁、50多岁和60多岁的患者，在发红和皮肤老化方面得到了持续改善。（4）美白淡斑娇韵诗参与的一项发表在Nature子刊上的研究发现：角质细胞释放的外泌体可以调节黑色素细胞的色素沉着，这种外泌体会携带有能力调节色素沉着的微小RNA与黑色素细胞进行交流制外泌体中包含的信息来发挥美白淡斑效果的光滑金虎尾果提取物。目前，光滑金虎尾果提取物已在娇韵诗护肤品中使用，即娇韵诗旗下的美白产品光芒小瓷瓶的主打美白成分之一（NatureCommunications.2015,24(6),7506)。法国化妆品原料商Silab与法国国家健康与医学研究院INSERM合作的研究发现，成纤维细胞外泌体在毛发生长中具有关键作用：真皮与毛囊之间的外泌体通讯是毛发生长的一条值得关注的生物学通路，来自成纤维细胞的外泌体能促进Norrin（一种能激活参与毛发生长的β-连环蛋白通路的配体）的分泌。Silab据此推出了一款能够作用于“真皮和毛囊之间的外泌体通天然生发成分HAIRGENYL®酵母提取物。2022年4月，韩国外泌体生物技术公司ExoCobio推出ASCEplus-HRLV，这是世界上首个基于外泌体的防脱生发产品。图33.ASCEplus防脱和抗皮肤衰老/抗炎作用;（Cells.2020,9(5):1157.）体外诊断/早期筛查因子、脂类物质等参与细胞间物质运输和信息传递，与多种疾病的发生和发展过程密切相关。特定的蛋白质、核酸、信号分子、脂质等可反映细胞水平的异常，可被用作疾病诊断的无创或微创生物标志物。作为新兴体外诊断技术，在肿瘤肿瘤及其他多种慢性疾病的筛查和诊断等领域应用前景巨大。外泌体已成为继循环肿瘤细胞（CTC）、循环肿瘤DNA（ctDNA）后液体活检领域研究的热点。相较于CTC、ctDNA两种检测方式，外泌体检测具有样本形式丰富、内含物更稳定两大优势，更易得到理想的检测浓度。图34.外泌体应用于肿瘤早筛的检测流程（2）中枢神经系统外泌体作为一种由细胞分泌的、能够通过全身循环和局部扩散作用介导细胞用。外泌体源性miRNA能通过血脑屏障，稳定且不易被降解，敏感性高，有望成为CNS疾病早期诊断指标；但是，需要提高脑脊液或血疾病的发生、发展以及参与疾病的机制等尚需进一步研究。（3）感染疾病外泌体参与细胞间信号传递、凝血、炎症和细胞内稳态等多种生物学过程影响感染性疾病的发生发展。越来越多的研究表明外泌体与感染性疾病的关联性，外泌体可能被用作感染性疾病的生物标志物，具有预防感染的可能性，毒）及其它感染性疾病诊断标记物，揭示外泌体能够为感染性疾病的诊断、治疗及预防提供新思路。（4）心血管疾病心血管疾病诊断的生物标志物主要是对已知心肌蛋白的靶向分析，肌酸激酶同工酶、肌红蛋白及肌钙蛋白等生物标志物目前已广泛应用于临床。肌钙蛋白是急性心肌梗死诊断的金标准，但对其他心血管疾病的诊断缺乏特异性。外泌体的成分和生物学内容物对细胞激活和损伤具有特异性，它们具有作为心血管疾病诊断和预后生物标志物的潜力。由于有些外泌体是在特定的应激条件或损伤条件下形成，因此循环的生物标志物的候选者。近年来研究发现外泌体miRNAs参与心血管疾病的生理和病理机制及外泌体miRNAs的临床应用已成为心血管疾病诊断研究的前沿和热点外泌体miRNAs作为急性心肌梗死、慢性心力衰竭和冠状动脉疾病等心血管疾病新的诊断性生物标志物有很好的研究前景。（5）呼吸系统疾病外泌体miRNA在呼吸系统疾病的疾病miRNA在特发性肺纤维化、慢阻肺、肺结核及哮喘等呼吸系统疾病的发病机制中具有重要意义，且它们具有非免疫原性和快速提取的特点，因此，外泌体miRNA有希望作为肺部疾病的一种新的诊断和治疗的生物标志物。3外泌体的生产与质控外泌体行业已经到了大规模产业化的前夕，规模化生产和质量控制成为非常重要的一环。生产工艺产量低、回收率或纯度低、靶向特异性差，使得外泌体的大规模生产仍是阻碍其发展的主要瓶颈之一。实验室阶段的外泌体生产具有一定的局限性，一些开放性操作拓展至放大生产时会导致一系列挑战，因此需要一些创新性的技术来衔接，以支持更大规模的生产需求。图35.外泌体实工业化生产源装载外泌体还需要经过工程化后再纯化，再制备成相应制剂。（1）外泌体的生产来源于干细胞和293细胞等动物细胞外泌体的收获需要先进行大规模细胞培养，以生产获得含有外泌体的原料。牛奶外泌体的收获不需要细胞培养，直接从新鲜牛奶中即可获取，是一个高效、大量获取外泌体的来源，最容易产业化。植物外泌体需对植物进行提取获得外泌体原料。烧瓶、多层细胞工厂等培养系统已经相当成熟，但不足以满足未来商业化可行性的需要。贴壁细胞培养平台扩大生产的技术要素主要集中在最大化培养表面积上，Cytiva推荐基于3D微载体贴壁悬浮培养的工艺。微载体（Microcarrier）培养系统是贴壁培养和悬浮培养相结合的一种操作单元，具有比表面积大、允许环境参数监控、方便取样、易于放大、可在无蛋白水解在线监控问题，又解决了悬浮的均质问题。图36.干细胞3D微载体培养生产外泌体来自马萨诸塞大学医学院的研究人员开发了一种稳健可放大的符合GMPs的赖性细胞培养并结合切向流过滤（TangentialFlowFiltration，TFF），使外泌体的产量提高了140倍，在治疗性siRNA转移至原代神经元的能力上具有在搅拌式生物反应器（SR）中使用微载体悬浮培养，可明显增加"贴环境时，搅拌和通气引起的剪切应力可能导致细胞及外泌体表型改有报道称，在转速为180rpm生物反应器中培养T淋巴细胞引起IL-2受体下调，细胞扩增减少。剪切应力可诱和细胞外信号相关激酶的机械转导途径，导致成骨分化，进而改变外泌体表至关重要。•HEK293细胞外泌体的获取HEK293细胞是一种悬浮适应细胞，在病毒载体（如LV、AAV）的生产中被尤其适合悬浮适应细胞的外泌体生产，与其他悬浮适应的细•牛奶外泌体的获取牛奶外泌体需从新鲜牛奶中提取制备，采用超速离心法(UC)或多种化学前处理方法去除乳蛋白，切向流超滤技术(TFF)进一步去除残留的乳蛋白，实现牛奶外泌体样品的初纯与浓缩。•植物外泌体的获取植物外泌体与其他外泌体的提取方式类似，可适用如超速离心法、免疫亲和捕获法等传统分离方法；但由于植物细胞存在细胞壁和机械组织，必要时也可以考虑纤维素酶解等辅助手段。例如浆果类植物，如番茄、荸荠等富含水分，仅需通过传统的机械粉碎结合已有的外泌体提取技术即可实现对外泌体的有效提取。而对于非浆果类植物，如人参、田七等块茎类药用植物，外泌体直接提取较为困难，需采用酶解等样品前处理手段。（2）外泌体的分离纯化外泌体分布在极其复杂的体系中，单一方法很难获得高纯度的外泌体，需要利用外泌体的不同物理化学和生化特性进行多方法的联合，这使得高产量的外泌体分离纯化非常具有挑战性。对于外泌体的分离纯化，可以通过确定的程序，超速离心法、超滤法、免疫亲和层析、基于电荷中和的聚合物沉淀法、尺寸排阻色谱、微流体技术、切向流过滤来完成产品的分离纯化（Theranostics2020;10(8):3684-3707）。公认的外泌体分离金标准方法。超速离心法需要昂贵的设备和训练有素的技术人员，特别是对于梯度超速离心。同时，分离的外泌体的结构和生物学功水平蛋白质聚集体和脂蛋白污染不利于外泌体的功能研究和药物开发超滤和尺寸排阻色谱法可以弥补此类问题。分离细胞外囊泡，并通过大小区分外泌体和核外颗粒体。与超速离心方法相比，大大缩短了处理时间并不需要特殊设备。重要的是，通过轻松调整滤光片大小，超滤允许研究人员对具有定义粒径的细胞外囊泡（包括特定亚群进行分类。该方法包括串联配置的微滤器和顺序超滤两种。图37.A.微滤器；B.顺序超滤运行模式包括直流过滤（DFF）或切向流过滤（TFF）。图38.切向流过滤示意图DFF对于采用离心式装置的较小流量（最多30mL）处理过程效果较好，但动式搅拌棒配置（搅拌槽）或通过生成一个受控的层流，在成交叉流。搅拌棒运行可改善超滤效果，但在获得最佳性能方面仍有局限性。因为搅拌速度和时序水平取决于棒体摆动范围，而此范围会随着摆动半径的改变而变化。切向流过滤（TFF）是一种应用于生物分子分离和纯化的快速有效的方法。该方法可用于各生物领域，例如免疫学、蛋白质化学、分子生物学、生物化学和微生物学。TFF可用于对容量从10mL到数千升的样品溶液进行浓缩和脱盐处理。此方法可用于分馏大小不一的生物分子、获取细胞上清液，以及对发酵培养基和细胞裂解物进行澄清处理。图39.切向流过滤设备由于效率高、设备成本低、操作快速、便携性良好、可达到中等纯度等优点，超滤越来越受欢迎。但在过滤可能由于堵塞和膜捕获而造成原料的损失。种细小的多孔材料，如葡聚糖聚合物（Sephadex）、琼脂糖（Sepharose）、聚丙烯酰胺（Sephacryl或BioGel）等被运用到SEC的优化中。图40.SEC尺寸排阻色谱法示意图该方法易于扩展和自动化，用于高通量外泌体制备。但设备成本相对较高，需要额外的外泌体富集方法。高度亲水的聚合物与外泌体周围的水分子相互作用，产生疏水性微环境，导至20000Da的PEG。该法易于使用、设备需求低、样品量兼容性高、效率高、可分离蛋白质聚集体、其他细胞外囊泡、聚合物污染物的污染物。但所需的处理时间较长，需要复杂的清理步骤，会影响下游分析和定量的结果。免疫亲和力捕获法是识别外泌体特异性标志物的抗体（固定在固体表面上）和外泌体的流体一起孵育富集外泌体，通过额外的洗脱步骤收集外泌体。外泌体标志物如Rab5、CD81、CD63、CD9、CD82、膜联蛋白和Alix等跨膜蛋白已被广泛用于商业化选择性外泌体分离。该方法具有较高的捕获效率和灵敏度，而且还可容纳较大的起始样品量；此外，该方法可以通过检测分离的外泌体上的疾病特异性标志物如EpCAM，CD133，EGFR直接转化为诊断图41.免疫亲和力捕获法示意图 外泌体的生物学功能，寻找对外泌体损伤更低的洗脱液，另外该法产量较低、抗体基成本较高的问题，化学抗体或许是下一步的改进方向。•微流体技术含外泌体的流体添加到介质中后，根据细胞外囊泡的物理和生化特性，分离外泌体，可以从少量体液中快速分离外泌体，并进行实时外泌体表征分析以进行原位诊断。该方法高效方便，但只适合小样本分离。质量控制作为新型生物制品，目前没有专门针对外泌体质量控制的法规和指导原则。但外泌体是细胞产物，其质量控制与指导原则可参照细胞产品相关原则。针对细胞治疗和细胞相关产品，FDA于2016年发布了“ContentandReviewofChemistry,Manufacturing,andControl(CMC)InformationforHumanSomaticCellTherapyInvestigationalNewDrugApplications(INDs)”，该指导原则就细胞库、生产过程中添加的各物料等在生物安全性、产品质量稳定性进行详细指导。价技术指导原则》及相关问题解读，该指导原则对细胞治疗及其相应产品在使用血清及其它物料、细胞库等存在风险进行评估指导。外泌体作为细胞代谢过程中的产物，产品的质量与宿主细胞的质量息息相关，诸多文献对外泌体GMP级生产流程进行优化和质量监控，主要包括上游细胞安全生产检测和下游外泌体生产检测。图42.GMP生产外泌体流程及质量监控图（1）细胞安全生产疗产品生产质量管理指南（试行）》，指导药品上市许可持有人规胞治疗产品的生产和质量管理，保证产品质量，同时，这也为细胞治疗药物研发企业提供了更清晰的研发、生产和发展路径。细胞制备应满足《中华人民共和国药典》、《药品生产质量管理规范》、《药品注册管理办法》、《药品生产监督管理办法》、《药品生产质量管理规范》及其附录、《药品注册办法》、《药品说明书和标签管理规定》、《药品生产企业现场检查风险评定原则》、《医疗废物管理条例》、《病原微生物实验室生物安全管理条例》。对细胞安全生产的基本要求：有细胞采集、加工、检定、保存和临床应用全过程的标准操作程序（SOP）和完整的质量管理记录；整个过程必须遵循细胞产品质量控制标准（QC），并拥有与其配套的检测设备和检测方法；细胞库的细胞必须保证可溯源；按照批准的细胞产品质量控制标准对每批次细胞产品进行严格检测，包括细菌、真菌、支原体和内毒素。（2）外泌体生产检测外泌体生产纯化过程中涉及到的关键设备、仪器、耗材及试剂，包括超速离期检查耗材的储存及有效期是否符合要求，保证所用原料、试剂与耗材的安全有效；最终产品质量严格遵循《细胞治疗产品研究与评价技术指导原则》对其进行相应检测。图43.外泌体质量控制项目目前亟需对不同分离方法在外泌体回收效率、纯度、蛋白标志物、装载药物量等方面进行评价，制定统一的流程和标准。科学家使用NanoFCM对不同样品外泌体用不同纯化方法纯化进行了研究，NanoFCM可在单颗粒水平对外泌体的颗粒浓度、大小、纯度、蛋白等进行表征，研究纯化方法对外泌体的影响，优化外泌体的纯化过程，有望为建立标准有效的外泌体分离和质控方法提供表征手段。4外泌体产业链分析外泌体产业处于起步阶段，尚未形成完善的产业链格局。产业链上游为原材料、设备、服务供应商；中游为外泌体治疗药物、医美产品、诊断试剂供应商；下游为流通和应用终端。图44.外泌体行业产业链分布产业链上游造设备、试剂、耗材，以及提供外泌体CRO与CDMO服务的相关企业；3）外泌体检测检测领域的上游供应商还包括提供抗原、抗体等试剂原料及设备部件的相关企业。目前国内主要制造设备、试剂和耗材仍以进口为主，跨国企业仍处于垄断地体科技（牛奶外泌体、干细胞外泌体、293细胞外泌体）、思珞赛等企业为代表；外泌体CRO服务主要以恩泽康泰生物等为代表。产业链中游产业链中游为利用上游供应商提供的原材料、设备、耗材、试剂进行外泌体相关治疗、美容、诊断等产品的研发、生产、销售。目前外泌体领域处于起国内以佰傲医学、天津外泌体科技等公司为代表。新药研发、诊断试剂均处于临床研究和临床前研究阶段，国外以ExoFlo、Codiak、Aegle、Exopharm、OBCTCD24、ILIAS、Evox、Exosome等为代表；国内以唯思尔康、纽兰生物、汇芯生物、安龄生物、亿微生物等为代表。产业链下游产业链下游为流通与终端机构。终端主要包括治疗药物面向的医疗机构、医美产品面向的医美机构、诊断产品面向的三方医检机构和医疗机构，以及护5产业驱动因素与挑战产业驱动因素（1）基础研究突破出，全球外泌体研发持续升温，有关外泌体载药、外泌体疗法、诊断和早筛等方向的研究成果陆续发表在Science、Nature等各大顶级期刊上，论文发为外泌体的应用与产业化探索奠定了坚实的基础。图45.外泌体学术研究成果发表情况（2）跨国药企布局大型跨国药企产业化合作的态势逐渐明朗。以礼来、武田、爵士制药为代表的大型跨国药企已经分别与拥有外泌体创新技术平药申请以及商业化推广。礼来制药：2020年6月9日，礼来公司与Ev协议，利用其技术平台开发递送RNA干扰药物和反义寡核苷酸药物(ASO)的工程化外泌体，治疗中枢神经系统疾病。利用外泌体递送蛋白质及mRNA核酸药物，治疗包括C型尼曼-皮克病在内（3）应用价值驱动蛋白、核酸等活性物质的纳米递送系统，还可以被用于诊断和早筛的无创或微创生物标志物，应用前景非常广阔。开启了纳米医学产业、细胞与基因治疗产业、医美与护肤产业和体外诊断产业的新篇章。（4）政策驱动强化上市后监管，建设药品监管科学研究基地，建设抗体药物、融合蛋白药物、生物仿制药、干细胞和细胞免疫治疗产品、基因治疗产品、外泌体治疗产品、中药等质量及安全性评价技术平台。（5）商业化驱动随着细胞与基因治疗产业的不断发展和成熟，外泌体产业的上游商业化技术不断完善，为外泌体产业奠定了商业化基础。图46.微载体大规模细胞培养生物反应器外泌体领域率先在医美和护肤品方面获得突破，产品全球销售，打开了产业化的大门；多种外泌体药物和外泌体诊断试剂也处于人体临床试验阶段，最快已处于III期临床，在安全性和有效性方面获得了一致认可。问题与挑战2023年，张琪、于湄、刘磊、田卫东等在《中国组织工程研究题和挑战（中国组织工程研究，2023，27(19):3052-3060）。（1）亲本细胞选择与培养目前，对于外泌体生产的最佳技术暂时还未达成共识。亲本细胞的选择构成了外泌体生产的首要关键步骤，不同的细胞生产的外泌体生物学特性有差异，研发人员需要根据外泌体的活性和组织归巢特性以及潜在的免疫原性和致癌性来选择亲本细胞。培养过程中的微小变化可能会改变外泌体的生物学特性。即使来源于相同的亲本细胞，由于培养条件的变化，比如亲本细胞的代数、培养方式、培养基等变化，最后得到的外泌体也有可能不同，这也是外泌体生产过程需要考虑的关键问题。从生产过程安全性的角度来看，最好使用封闭式系统，但这比开放式系统更难监控。牛奶来源的外泌体是获得大量生物相容性外泌体的有效替代来源，从复合牛奶中大规模获取外泌体更加适合工业化生产。（2）分离纯化工艺外泌体的分离纯化也是一个不容忽视的关键程序。不同的分离提纯方法得到的外泌体产量差距悬殊，外泌体亚群也有所不同，这为质量控制带来了挑战。目前亟需对不同分离纯化方法在外泌体回收效率、纯度、蛋白标志物、装载药物量等方面进行评价，制定统一的流程和标准。（3）成分表征外泌体的表征集中在测量颗粒大小和数量，以及检测特定的表面蛋白和货物。透射电子显微镜成像是表征外泌体结构和大小的标准方法。此外，扫描电子显微镜和动态光散射可以对外泌体进行表征。合格的体外表征与量化可以预测