生物化学 第六节蛋白质的分离 第七节蛋白质的分类

第六节蛋白质的分离

一．蛋白质的提取蛋白质提取的步骤：

1）、材料选择

2）、细胞粉碎

3）、提取二．蛋白质的分离纯化（一）根据溶解度不同的分离纯化方法（二）根据分子大小不同的分离纯化方法（三）根据电离性质不同的分离纯化方法（四）根据配基特异性的分离纯化方法（一）根据溶解度不同的分离纯化方法1）、等电点沉淀法蛋白质在等电点时溶解度最小，容易发生沉淀，但沉淀不完全。在等电点处再加盐，沉淀完全。2）、盐析沉淀法中性盐对蛋白质胶体的稳定性有显著影响，且盐析沉淀的蛋白质一般保持天然构象而不变性制备具有生物学活性的蛋白质如酶，激素等。3）、低温有机溶剂沉淀法：有机溶剂破坏水化膜使蛋白质沉淀，如用冷乙醇从血清中分离制备人体蛋白和球蛋白。4）、温度对蛋白质溶解度的影响温度提高，虽然蛋白质溶解度增加但是容易变性所以低温操作。（二）根据分子大小不同的分离纯化方法1）、透析和超滤法：透析利用蛋白质大分子不可透过半透膜的性质（胶体性质）。常用于蛋白质脱盐，但是需要的时间长。超滤法（ultrafiltration）利用超滤膜在一定压力或离心力作用下，大分子物质被截留而小分子物质则被滤出。常用于蛋白质浓缩，脱盐。方便快速，大容量。2）、分子排阻层析：（molecular-exclusionchromatography）

利用分子筛性质来分离蛋白质，常用的凝胶有a）葡聚糖凝胶；b）聚丙烯酰胺凝胶；c）琼脂糖凝胶。3）、密度梯度离心（densitygradientcentrifugation）

（三）根据电离性质不同的分离纯化方法1）、电泳法：带电荷的蛋白质分子在电泳场中根据其电荷量和形状不同而被分离分离的蛋白量少。（如PAGE电泳，上样量少）2）、离子交换层析：利用蛋白质的两性解离性质，使其结合在离子交换剂上，最后再将结合的目标蛋白洗脱下来，用于大量制备浓缩。但有的树脂较贵，如DEAE，100g/400-600元（四）根据配基特异性的分离纯化方法

亲和层析（affinitychromatography）：又称选择层析，功能层析等。蛋白质与其相对应的化合物（称为配基）具有特异结合的能力，即亲和力。这种亲和力具有下列重要特性：a）、高度特异性；b）、可逆性三．蛋白质的纯度鉴定和含量测定（一）、蛋白质纯度的鉴定

1）、层析法“层析纯”

2）、电泳法“电泳纯”如SDS3）、免疫化学法“免疫纯”（二）、蛋白质的含量测定1）、凯氏定氮法（Kjedahl法）：测定基础是蛋白质含N量均大约为16%。蛋白质样品经浓硫酸消化，其中的氨转变为硫酸铵，经强碱碱化放出氨，通过水蒸汽蒸馏法蒸出并以硼酸液吸收。最后用标准硫酸溶液滴定，测出释放的氨含量，并计算样品中的氮素含量，再乘以6.25即为样品中蛋白质含量。凯氏定氮法是测定蛋白质含量的经典方法，也是药典规定的方法。2）、福林-酚试剂法（Lowry法）原理：蛋白质与福林-酚试剂呈色反应（实质上是蛋白质分子中含酚基的Tyr）与试剂的显色反应。应用最广泛，灵敏度在ng级。3）、双缩脲法：碱性环境下，铜离子与双缩脲的亚酰胺键反应生成紫红色。而肽键与亚酰胺键结构相同，所以也能出现此种反应。但由于蛋白质由多个氨基酸通过多个肽键构成，分子中肽键多，所以显色也深，定性定量。灵敏度较福林-酚法低，mg级。4）、紫外分光光度法

芳香族氨基酸Tyr，Trp，Phe，在280nm处有最高吸收值。快速，简便，不损失样品，且灵敏度在0.1-0.5mg。5）BCA比色法：Pr还原的Cu与BCA试剂发生紫色反应6）Bradford蛋白分析法：考马斯亮兰G-250染色，2.5ug/ml；氨基酸、肽，EDTA、Tris、糖等无干扰

第七节蛋白质的分类一．根据分子形状分类

1．球状蛋白长轴:短轴<10，丙球

2．纤维蛋白长轴:短轴>10，胶原蛋白二．根据其组成分类1.单纯蛋白，水解物全部为氨基酸2.结合蛋白，水解物除氨基酸外还有非蛋白成分。重要的有：

a）、糖蛋白b）、核蛋白c）、脂蛋白糖蛋白与蛋白多糖（glycoproteinandproteoglycan）

两者都为蛋白质与糖类相结合而构成，但两者之间又有区别：糖蛋白是以蛋白质为主体，糖是它的辅基(如唾液中的粘蛋白和细胞膜内的糖蛋白）。蛋白多糖则是以多糖为主（有的蛋白多糖中，糖可达到95%，动物结缔组织中蛋白多糖为其主要成分之一）。核蛋白实验六，核酸的提取根据溶解度分类1）可溶性蛋白

2）醇