TNAIA 0311-2024 支原体中西药MIC检测标准操作规程

ICS65.020.30CCSA031T/NAIA团 体 标 准T/NAIA0311—2024MICStandardOperatingProceduresforMICDetectionofMycoplasmainTraditionalChineseandWesternMedicine2024-10-02发布 2024-10-20实施宁夏化学分析测试协会 发布II前  言GB/T1.1—20201草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由宁夏化学分析测试协会提出并归口。业农村局。本文件主要起草人：郭亚男、王小龙、曹晓真、王建东、梁小军、邵喜成、伏耀明、马科、谢文青、摆世林、于有利、张久盘、张奎举、谢建亮、李毓华、岳康、王鑫、牛晓昊。T/NAIA0311—2024T/NAIA0311—2024PAGEPAGE10支原体中西药MIC检测标准操作规程范围本文件规定了支原体中药和西药最小抑菌浓度检测技术的术语和定义、原理、标准操作规程、结果判断依据和操作注意事项。本文件适用于鸡、牛和羊支原体。规范性引用文件凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB18597危险废物贮存污染控制标准CLSIM100-S22抗生素敏感性检测操作标准术语和定义下列术语和定义适用于本标准。3.1支原体mycoplasma柔膜体纲、支原体目、支原体科、支原体属中的成员，结构较简单，无细胞壁，没有细胞核，仅有核糖体。3.2最小抑菌浓度minimuminhibitoryconcentration(MIC)一种在特定环境下孵育24小时，可抑制某种微生物出现明显增长的最低药物浓度即最小抑菌浓度，用于定量测定体外抗菌活性。3.3颜色变化单位colorchangeunit(CCU)以微生物在培养基中的代谢活力为指标，来计数微生物的相对含量的计数单位。3.4胸膜肺炎样微生物培养基pleuropnenmonia-likeorganismmediumPPLO即支原体培养基，主要用于多种支原体的分离和培养。原理PPLO将药物进行倍比稀释1mL（MIC），亦即被测支原体对该药的敏感度。操作程序仪器与耗材0.2mL122mLEP冰箱，天平，高压消毒锅，移液器及枪头，0.22µm操作步骤药液的制备西药配置1mg/mL保存。使用前将储存液使用去离子水稀释至所需工作液浓度，0.22µm，4℃保存备用。不同药物CLSIM100-S22中药配置100.5h，40min，830min，1g/mL，-80℃使用前将储存液使用去离子水稀释至所需工作液浓度，0.22µm，4℃保存备用。CCU将保存于-8030100µLPPLO37℃48h～72h100µLPPLOCCU。1×101～1×1011（1112377d，以培养基由红色变为橙黄色时的最高稀释度作为颜色改变单位CCU，菌液浓度以CCU/mL最小抑菌浓度的测定菌液配置103～105CCU/mL验操作误差及错误判断。药物配置及操作CLSI（MIC）122管～12100μLPPLO1100μL1210100μL，1～10100μL11100L1231237℃48h，在不同时间观察每个孔内颜色的变化并记录，MIC（μg/mL）。结果测定对受试细菌按测得的MIC值水平从低往高计算累积分布频数，然后计算累积分布率，最终测到MIC50和MIC90。数据处理采用SPASS软件对支原体菌株耐药性结果进行统计分析。结果判定根据西药和中药的MIC值，将支原体对药物的敏感性分为敏感(Susceptible,S)、中度敏感(Intermediate,I)（Resistant,CC.2MIC实验废弃物的处理121C30minGB18597附录A（规范性）试剂配制均为分析纯。抗菌药配制注意事项鉴于多种抗菌药均为复合盐类，并有纯度标识，配制时，应扣除杂质部分和辅助基团质量，只考虑纯198%582.58g/mol；而卡那霉素基484.50g/mol484.50/582.58(98%=0.815)5mg1个水的盐酸卡那霉4.075mg（5mg*0.815=4.075mg）5mg4.075mL1mg/mL的贮存液；不同抗菌药需要不同的溶剂溶解。操作时，先用少量合适溶剂溶解，再用去离子水稀释成贮存浓度为1mg/mL；pH7.8，以避免导致支原体培养物出现非特异性颜色变化；0.22µm～80℃4℃备用。西药溶剂和稀释液的配制参照CLSIM100-S22配制，具体见表A.1.1。表A.1.1抗菌药贮存液与工作液配制所选择的溶剂和光敏感性药物类别药物名称溶剂稀释液贮存液浓度mg/mL工作液浓度µg/mL光敏感性喹诺酮类环丙沙星Ciprofloxacin水水132是达氟沙星Danofloxacin水水116是恩诺沙星Enrofloxacin0.1M氢氧化钠水132是马波沙星Marbofloxacin水水164是大环内酯类泰乐菌素水水132否tylosin托拉菌素tulathromycin0.015M柠檬酸水51024否阿奇霉素azithromycin0.1M乙酸水164否红霉素Erythromycin95%乙醇水164是地红霉素Dirithromycin0.1M乙酸水1128否罗红霉素Roxithromycin95%乙醇水164否替米考星Tilmicosin0.01M盐酸水1512是螺旋霉素Spiramycin95%乙醇水1512否氨基糖苷类妥布霉素Tobramycin水水164否庆大霉素Gentamicin水水1256否壮观霉素Spectinomycin水水1256否卡那霉素Kanamycin水水132是苯丙醇氟苯尼考Florfenicol95%乙醇水132否甲砜霉素Thiamphenicol95%乙醇水3512是四环素类四环素Tetracycline水水116是多西环素Doxycycline水水132是金霉素Chlortetracycline0.01M盐酸水164是林可胺酰胺类林可霉素Lincomycin水水132否甘氨酰环素替加环素Tigecycline水水1128否双萜烯类泰妙菌素Tiamulin95%乙醇水1128是氟奎诺酮类恩诺沙星Enrofloxacin0.01M盐酸水1128否中药溶剂和稀释液的配制表A.1.2中药贮存液与工作液配制所选择的溶剂药物名称溶剂稀释液贮存液浓度g/mL工作液浓度µg/mL光敏感性知母水水1125否桔梗水水162.5否甘草水水1250否川芎水水1500否当归水水11000否冬花水水1125否枳壳水水1500否浙贝水水1500否苏籽水水1500否厚朴水水162.5否生姜水水11000否柴胡水水1250否杏仁水水11000否紫苏水水1250否黄连水水131.5否茯苓水水11000否穿心莲水水1125否黄芩水水132.5否鱼腥草水水17.81否麻黄水水162.5否板蓝根水水1500否党参水水11000否黄柏水水115.63否苦参水水115.63否百部水水1250否金银花水水1500否红花水水1500否大青叶水水11000否支原体液体培养基PPLO21g，2.5g，1g，0.2g800mL，12120min后，添加马血清200mL，8万单位青霉素0.1g，0.05%酚红1mL，4℃保存。支原体固体培养基PPLO30g，2.5g，1g，0.2g800mL，12120min后，添加马血清200mL，8万单位青霉素0.1g，0.05%酚红1mL，4℃保存。附录B（资料性）支原体颜色变化单位测定方法支原体颜色变化单位的测定121.5mLEP900μLPPLO1100μL100μL2100μL3137℃48h～725105CCU/mL。牛津杯法体外药敏试验1:1000100μL37℃48h，测定抑菌圈大小并判定敏感性。附录C（规范性）药物敏感性判断标准MICMIC96100µL1237℃48h，内颜色的变化并记录，不改变颜色的药物最高稀释倍数对应管的抗菌药浓度（µg/mL）MIC。药物敏感性判断标准MIC(Susceptible,S)、中度敏感(Intermediate,I)耐药（Resistant,R）C.1，C.2.表C.1支原体对各种西药敏感性判断值药物类别药物名称药物浓度（µg/mL）敏感中介耐药喹诺酮类环丙沙星Ciprofloxacin≤12≥4a达氟沙星Danofloxacin≤12-4＞8a恩诺沙星Enrofloxacin≤12-4＞8a大环内酯类泰乐菌素tylosin≤0.51-4≥8托拉菌素tulathromycin≤1632≥64阿奇霉素azithromycin≤24≥8红霉素Erythromycin≤24≥8地红霉素Dirithromycin≤24≥8罗红霉素Roxithromycin≤24≥8替米考星Tilmicosin≤24≥8螺旋霉素Spiramycin≤24≥8氨基糖苷类妥布霉素Tobramycin≤48≥16a庆大霉素Gentamicin≤48≥16氨基糖苷类壮观霉素≤48≥16Spectinomycin卡那霉素Kanamycin≤48≥16苯丙醇氟苯尼考Florfenicol≤24≥8甲砜霉素Thiamphenicol≤816≥32四环素类四环素Tetracycline≤48≥16a多西环素Doxycycline≤48≥16a金霉素Chlortetracycline≤48≥16林可胺类林可霉素Lincomycin≤2-≥4甘氨酰环素替加环素Tigecycline≤2-≥4双萜烯类泰妙菌素Tiamulin≤0.51-4≥8氟奎诺酮类恩诺沙星Enrofloxacin≤48≥16表C.2支原体对各种中药敏感性判断值药物名称药物浓度（µg/mL）敏感中介耐药知母≤64-≥128桔梗≤64-≥128甘草≤64-≥128川芎≤64-≥128当归≤64-≥128冬花≤64-≥128枳