T-SATA 077-2024 血清中20 种类固醇激素的测定 高效液相色谱-串联质谱法

ICS03.080.99CCSX00血清中20种类固醇激素的测定Determinationof20steroidhormonesinserum——HighperformanceliquidchromatographytandemmasssIT/SATA077—2024前言 2规范性引用文件 3术语和定义 4原理 25试剂与材料 26仪器和设备 27分析步骤 38结果计算 49灵敏度、精密度 4附录A（资料性）20种类固醇激素标准品信息、保留时间及内标物 5附录B（资料性）20种类固醇激素及内标物定量定性离子对及去簇电压、碰撞能量 6附录C（资料性）20种类固醇激素及11种内标物多反应监测（MRM）质量色谱图 8附录D（资料性）20种类固醇激素的检出限、定量限 参考文献 T/SATA077—2024本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。本文件由深圳市计量质量检测研究院提出。本文件由深圳市分析测试协会归口。本文件起草单位：深圳市计量质量检测研究院、深圳市宝安区公共卫生服务中心、深圳深检集团医学检验实验室、深圳市农产品质量安全检验检测中心、深圳市龙岗中心医院、四川大学、南方科技大学医院、深圳市人民医院、广州中医药大学深圳医院（福田）、深圳市龙岗妇幼保健院、深圳恒生医院。本文件主要起草人：李子樱、陈欣、刘爱平、谷素英、肖伟敏、孙亮、杨国武、孙丽萍、刘成文、曾懿、王力弘、赵云霞、张玉鑫、陈佳平、王奇、罗敏、于建渤、李博、李小峰、李永新、袁小澎、赵洪悦、纪昕、于波海、周珍文、张光辉。1T/SATA077—2024血清中20种类固醇激素的测定高效液相色谱-串联质谱法本文件规定了血清中20种类固醇激素（褪黑素、脱氢表雄酮、雄烯二酮、睾酮、双氢睾酮、孕烯醇酮、孕酮、17α-羟孕酮、21α-羟基孕酮、11-脱氧皮质醇、21-脱氧皮质醇、皮质酮、可的松、氢化可的松、雌酮、雌二醇、雌三醇、17α-羟基孕烯醇酮、醛固酮、硫酸脱氢表雄酮）的液相色谱-串联质谱测定方法。本文件适用于血清中20种类固醇激素的测定。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T32465-2015化学分析方法验证确认和内部质量控制要求WS/T478-2024血清25-羟基维生素D2和D3的检测同位素稀释液相色谱串联质谱法WS/T225-2024临床化学检验血液标本的采集与处理WS/T661静脉血液标本采集指南WS/T408-2024定量检验程序分析性能验证指南3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1内标internalstandard在定量分析时，加入到样品中作为参比物的已知量的化合物纯品。3.2检出限limitofdetection检测方法在规定的实验条件下所能检出分析物的最低浓度。3.3定量限limitofquantification在满足实验室对准确性和精密度要求的前提下，检测方法在规定的实验条件下所能准确定量检测分析物的最低可测量浓度或量。3.4线性linearity在给定的测量范围内，使测定结果与样品中分析物的量直接成比例的能力。此处的测定结果指最终的分析结果，而非仪器输岀的原始信号。3.5线性范围linearrange使实验系统的最终分析结果为可接受的线性的浓度范围，此时非线性误差应低于允许误差。3.6基质效应matrixeffect2T/SATA077—2024标本中除分析物之外的样品性质对分析物测定结果的影响。4原理试样以乙酸乙酯溶液作为萃取剂，通过液液萃取的原理将血清中的类固醇激素富集至萃取剂中，得到血清中分离和纯化的类固醇激素，用高效液相色谱-串联质谱测定，通过建立的标准品标准曲线与各自内标峰面积比计算血清中20种类固醇激素的浓度。5试剂与材料除另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。5.1试剂5.1.1甲醇（CH4O）：质谱纯。5.1.2乙酸乙酯（C4H8O2）：质谱纯。5.1.3乙酸铵（CH3COONH4）：分析纯。5.2试剂配制5.2.10.1mol/L乙酸铵溶液：准确称取1.000g乙酸铵，加入130mL水溶解备用。5.2.21mmol/L乙酸铵溶液：准确移取0.1mol/L乙酸铵溶液（5.2.1）1mL，至100mL容量瓶，用水定容至刻度备用。5.2.31mmol/L乙酸铵-甲醇溶液：用1mmol/L乙酸铵溶液（5.2.2）和甲醇（5.1.1）按6：4体积比混合备用。5.3标准品类固醇标准物质及稳定同位素内标物，纯度大于或等于95%或有证标准物质，20种类固醇激素中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子质量等详见附录A。5.4标准溶液配制5.4.1外标标准储备液（500μg/mL）：分别准确称取50.0mg（精确至0.0001g）各标准品，用甲醇溶解并转移至100mL容量瓶中，定容至刻度，配制成浓度为500μg/mL标准储备液，于-20℃避光保存，可稳定6个月。5.4.2外标混合标准中间液（10.0μg/mL)：准确移取500μL各类固醇激素标准储备液（5.4.1）于25mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度。于-20℃避光保存，可稳定3个月。5.4.3内标混合标准储备液（5.00μg/mL)：分别移取500μL各内标单标标准溶液（100μg/mL）至10mL容量瓶，用甲醇定容至刻度（若购买的内标为固体标准品，则需先配制成浓度为100μg/mL的内标单标溶液）。于-20℃避光保存，可稳定2个月。5.4.4外标混合标准工作液（1.00μg/mL准确移取500μL外标混合标准中间液（5.4.2）至5mL容量瓶中，用1mmol/L乙酸铵-甲醇溶液（5.2.3）定容至刻度。临用前配制。5.4.5内标混合标准工作液（200ng/mL）：准确移取200μL内标混合标准储备液（5.4.3）至5mL容量瓶中，用1mmol/L乙酸铵-甲醇溶液（5.2.3）定容至刻度。临用前配制。6仪器和设备6.1液相色谱-串联质谱仪：配置电喷雾电离源。6.2分析天平：感量0.000lg。6.3涡旋混合器。6.4离心机：转速不低于10000r/min。6.5冷冻抽干机。3T/SATA077—20247分析步骤7.1样品前处理准确移取100μL血清样本，加入10.0μL200ng/mL内标混合标准工作液（5.4.5加入1.2mL乙酸乙酯溶液（5.1.2），涡旋提取（2500rpm，10min），冰上孵育10min，离心（18000rpm，4℃,10min），取上清液进行冷冻抽干，用100μL1mmol/L乙酸铵水溶液-甲醇溶液（v/v=6：4）复溶，离心（18000rpm，4℃,10min），取上清液于样品瓶中，用于LC-MS/MS检测分析。7.2仪器参考条件7.2.1液相条件a)色谱柱：C18液相色谱柱（2.7µm2.1×100mm），或相当者；b)流动相：1mmol/L乙酸铵水溶液（流动相A）和甲醇溶液（流动相B）；c)流速：0.3mL/min；e)进样量：5µL；f)洗脱梯度见表1。表1超高效液相色谱洗脱梯度参考条件7.2.2质谱条件a)离子源：电喷雾离子源(ESI)；b)检测方式：多反应监测(MRM)；c)扫描方式：正离子模式、负离子模式；d)电喷雾电压：1.75kV(+)/3.00kV(-)；e)离子源温度：600℃;f)雾化气：7.0Bar；g)去溶剂气流量：1000L/hr；h)锥孔反吹气流量：150L/hr；i)监测离子对和定量离子对等信息详见附录B；20种类固醇激素及11种内标物的多反应监测（MRM）质量色谱图详见附录C。注：对于不同质谱仪器，仪器参数可能存在差异，测定前应将质谱参数优化到最佳。7.3标准曲线的制作内标混合标准工作液（5.4.5）配制混合标准溶液工作曲线：0.01ng/mL、0.02ng/mL、0.05ng/mL、0.10ng/mL、0.20ng/mL、0.50ng/mL、1.00ng/mL、2.00ng/mL、5.00ng/mL、10.0ng/mL、20.0ng/mL、4T/SATA077—202450.0ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、500ng/mL。标准系列工作溶液中各内标的浓度为20ng/mL。不同物质根据实际情况采用不同范围的标准曲线。将标准系列工作液由低浓度到高浓度依次进样，以待测类固醇激素与对应同位素内标的峰面积比值为纵坐标，以标准系列工作液浓度（ng/mL）为横坐标，分别绘制20种类固醇激素的标准曲线。7.4定性和定量7.4.1保留时间被测试样中目标色谱峰与相应标准色谱峰的保留时间相比较，相对误差应在±2.5%之内。7.4.2离子丰度比按照高效液相色谱-串联质谱条件测定试样和标准工作溶液，记录试样和标准溶液中各化合物的色谱保留时间，以相对于最强离子丰度的百分比作为定性离子对的相对丰度，记录浓度相当的试样与标准工作溶液中相应成分的相对离子丰度，定性时离子丰度比的最大允许偏差见表2。表2定性时离子丰度比的最大允许偏差7.4.3试样溶液的测定将处理完毕的试样（7.1）按仪器参考条件（7.2）进行测定，得到相应的样品溶液的色谱峰面积。根据标准曲线得到待测液中组分的浓度，平行测定次数不少于两次。8结果计算将液相色谱-质谱测得浓度代入下式计算含量：式中：X——试样中各待测物的含量，单位为纳克每毫升（ng/mL）；c——从标准曲线中读出的供试品溶液中各待测物的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mLV1——样液最终定容体积，单位为毫升（mL）；V2——取样体积，单位为毫升（mLK——稀释倍数。结果保留三位有效数字。9灵敏度、精密度9.1灵敏度各类固醇激素的检出限及定量限见附录D。9.2精密度依据已发布的行业标准等规范性文件，对方法的精密度进行验证，定量检测下限浓度附近低值CV＜20％,其余浓度CV＜15％。5T/SATA077—2024（资料性）20种类固醇激素标准品信息、保留时间及内标物20种类固醇激素标准品信息及内标物见表A.1。表A.120种类固醇激素标准品信息、保留时间及内标物1CHNO2CHO3CHO4CHO5DehydroepiandrosteronesulfCHOS6CHO7CHO8CHO9CHOCHOCHOCHOCHOCHOCHOCHOCHOCHOCHOCHO6T/SATA077—2024（资料性）20种类固醇激素及内标物定量定性离子对及去簇电压、碰撞能量20种类固醇激素及内标物定量定性离子对及去簇电压、碰撞能量见表B.1。表B.120种类固醇激素及内标物定量定性离子对及去簇电压、碰撞能量1234567897T/SATA077—2024注：带为定量离子。8T/SATA077—2024（资料性）20种类固醇激素及11种内标物多反应监测（MRM）质量色谱图9T/SATA077—2024图C.120种类固醇激素及11种内标物多反应监测（MRM）质量色谱图T/SATA077—2024（资料性）20种类固醇激素的检出限、定量限20种类固醇激素的检出限、定量限见表D.1。表D.120种类固醇激素的检出限、定量限12234567892DehydroepiandrosteronesuT/SATA077—2024参考文献[1]KarashimaS,OsakaI.Rapidityandprecisionofsteroidhormonemeasurement[J].Journalofclinicalmedicine,2022,11(4):956.[2]TaylorDR,GhataoreL,CouchmanL,etal.A13-steroidserumpanelbasedonLC-MS/MS:useindetectionofadrenocorticalcarcinoma[J].Clinicalchemistry,2017,63(12):1836-1846.[3]JiaY,LiuX,XuL,etal.Liquidchromatography-tandemmassspectrometrym