1.2基因工程的基本操作程序

1.2基因工程的基本操作程序实施基因工程第一步

目前常用的方法有:1、从自然界已有的物种中分离

2、用人工方法合成目的基因的获取目的基因:主要指编码蛋白质的结构基因。

也可以是一些具有调控作用的因子。1.2

基因工程的基本操作程序原核细胞的基因结构非编码区非编码区编码区(编码区上游)(编码区下游)与RNA聚合酶结合位点启动子终止子编码区非编码区不编码蛋白质，有调控作用编码蛋白质编码区非编码区外显子：能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列不编码蛋白质，有调控作用编码区非编码区非编码区启动子终止子编码区上游编码区下游外显子内含子与RNA聚合酶结合位点（间隔的、不连续的）真核细胞的基因结构1.从基因文库中获取目的基因。

(1)概念：

将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库。一、目的基因的获取(2)分类：(3)基因文库的构建基因组文库部分基因文库基因组文库：包含了一种生物所有的基因。部分基因文库：包含了一种生物的一部分基因。基因组文库的构建通过对受体菌的培养而储存基因mRNA单链cDNA双链cDNA反转录DNA聚合酶cDNA文库的构建2.利用PCR技术扩增目的基因（1）PCR——__________反应

PCR技术是一项在生物_____复制____________的核酸合成技术。（使用PCR扩增仪）（2）原理：（3）前提：要有一段______________的核苷酸序列，以便根据这一序列合成_____。（4）过程：（5）比较PRC技术与细胞中的DNA复制一、目的基因的获取DNA双链复制原理多聚酶链式体外特定DNA片段已知目的基因引物PCR技术DNA复制相同点原料条件不同点场所酶解旋方式结果四种脱氧核苷酸模板、ATP、酶体外复制细胞核内热稳定DNA聚合酶（Taq酶）细胞内的DNA聚合酶、解旋酶DNA在高温下变性解旋解旋酶催化在短时间内形成大量的DNA片段形成整个DNA分子3.人工合成基因一、目的基因的获取反转录法根据已知的氨基酸序列合成DNA目的基因的mRNA单链cDNA双链cDNA(即目的基因)反转录DNA聚合酶蛋白质的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列推测推测目的基因化学合成二、构建表达载体同一种目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并遗传给下一代，使目的基因表达和发挥作用。P15思考3&4几种常见的转化方法：1、导入到植物细胞2、导入到动物细胞3、导入到微生物细胞三、导入受体细胞显微注射技术转化

：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。农杆菌转化法

基因枪法

花粉管通道法三、导入受体细胞导入植物细胞：农杆菌转化法土壤农杆菌：具有趋化性（酚），感染双子叶植物和裸子植物三、导入受体细胞基因枪法：

单子叶植物常用的一种基因转化方法，但成本较高。三、导入受体细胞花粉管通道法：

十分简便经济的方法。我国的转基因抗虫棉就是用此方法获得。三、导入受体细胞显微注射法

重组DNA提纯取卵（受精卵）显微注射受精卵发育新性状动物三、导入受体细胞导入到微生物细胞将目的基因转到大肠杆菌细胞中的操作步骤：1)获得目的基因和质粒载体；2)形成重组质粒；3)用Ca+处理，制备感受态细胞,用重组质粒转化大肠杆菌细胞；4)培养大肠杆菌，让重组质粒形成大量拷贝；5)筛选含重组质粒的大肠杆菌细胞。1.筛选含有目的基因的受体细胞（1）抗药性筛选法——标记基因（2）DNA分子杂交：2.检测目的基因的表达——性状体现（1）检测目的基因是否转录出了mRNA（2）检测目的基因是否翻译成蛋白质（3）检测性状四、目的基因的检测与鉴定分子杂交抗原—抗体杂交——个体生物学水平抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等四、目的基因的检测与鉴定DNA分子杂交示意图