T-BPMA 30-2024 畜禽肉中食源性兴奋剂和孕激素的测定 液相色谱-串联质谱法

ICS67.120CCSX04BPMADeterminationoffood-bornestimulantdrugsandprogestinsinmeat—Liquidchromatography-tandemmassspectrometrymethodIT/BPMA30—2024本文件按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由北京市科学技术研究院分析测试研究所（北京市理化分析测试中心）提出。本文件由北京预防医学会归口。本文件起草单位：北京市科学技术研究院分析测试研究所（北京市理化分析测试中心北京市疾病预防控制中心，北京市延庆区疾病预防控制中心。本文件主要起草人：冯月超、刘艳、王建凤、郭巧珍、姚凯、张晶、林强、李晶晶、苏东霞。1T/BPMA30—2024本文件描述了畜禽肉中40种食源性兴奋剂和5种孕激素含量测定的液质联用测定方法。本文件适用于畜禽肉中40种食源性兴奋剂和5种孕激素含量的测定。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。4方法原理样品中的被测物经0.5%乙酸乙腈溶液振荡提取，加入氯化钠和无水硫酸镁脱水离心。上清液采用乙二胺-N-丙基硅烷化硅胶（PSA）、十八烷基键合硅胶（C18）、中性氧化铝和无水硫酸镁净化。采用液相色谱-串联质谱法测定，内标法定量。5试剂和材料5.1试剂除另有说明外，所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。5.1.1甲醇（CH3OH）：色谱纯。5.1.2乙腈（CH3CN）：色谱纯。5.1.3无水硫酸镁（MgSO4）。5.1.4氯化钠（NaCl）。5.1.5冰乙酸（CH3COOH）：优级纯。5.1.6甲酸（HCOOH）：色谱纯，纯度≥88%。5.1.7乙酸铵（CH3COONH4）：优级纯。5.1.8中性氧化铝（Al2O30.15mm~0.30mm（100~200目层析用。5.1.9提取液：取5mL冰乙酸加入乙腈，并用乙腈定容于1000mL，混匀。5.1.100.1%甲酸-5mmol/L乙酸铵水溶液：称取0.385g乙酸铵用水溶解，加入1.0mL甲酸，用水定容至1000mL。5.1.11复溶溶液：取0.1%甲酸-5mmol/L乙酸铵水溶液（5.1.10）90mL，加入10mL甲醇混匀。5.1.12标准品：45种被测化合物和9种内标物的中英文名称和CAS号信息见附录A，纯度≥95%。2T/BPMA30—20245.1.13标准储备溶液：准确称取附录A中的标准品适量（相当于各被测物的有效成分10mg），精密称定，分别用甲醇适量使溶解并定容于10mL，配制成浓度为1.0mg/mL的标准储备溶液。-18℃以下避光储存，其中利尿剂（氨苯喋啶、螺内酯、坎利酮）保质期为3个月，其余有效期为6个月。5.1.14混合标准储备溶液：依据化合物的类别将被测物分成A~G共7组，见附录B，其中A-F组为外标，G组为内标。用甲醇配制成7个混合标准储备溶液，配制浓度见附录B。-18℃以下避光储存3个月。5.1.15内标混合标准中间溶液：取G组内标混合标准储备液适量，用甲醇配制成0.1μg/mL~0.4μg/mL的内标混合中间溶液，见附录B。5.1.16外标混合标准中间溶液：临用前分别取上述A~G组混合储备溶液1.00mL，用甲醇定容于10mL容量瓶，配制成外标混合中间溶液，浓度范围时0.1μg/mL~0.4μg/mL，见附录B。5.1.17溶剂标准工作溶液：分别移取0mL、0.1mL、0.2mL、0.5mL、0.8mL、1.0mL外标混合中间液于10mL容量瓶，均加入0.1mL内标混合标准中间液，用复溶溶液（5.1.11）定容至刻度，混匀。5.2材料5.2.1乙二胺-N-丙基硅烷化硅胶（PSA）：粒径40μm~60μm。5.2.2十八烷基键合硅胶（C18）：粒径40μm~60μm。5.2.3净化管：分别称取吸附材料PSA（5.2.1）、C18（5.2.2）、中性氧化铝（5.1.8）各165mg，无水硫酸镁（5.1.3）900mg于10mL螺盖离心管中。5.2.4微孔滤膜：尼龙，0.22μm。6仪器和设备6.1液相色谱-三重四极杆串联质谱仪：配电喷雾离子源（ESI）。6.2离心机：转速不低于8000r/min。6.3氮气吹干仪。6.4超声波清洗器。6.5多管涡旋混匀仪。6.6涡旋混合器。6.7分析天平：感量0.01g和0.00001g。7试样制备和保存7.1试样制备取500g畜禽肉样品，绞碎均质后的供试样品，作为供试样品。7.2试样保存-18℃以下保存。8测定步骤3T/BPMA30—20248.1样品的处理8.1.1提取称取粉碎均质后的试样5.0g（精确至0.01g）于50mL螺盖离心管中，加入40μL内标混合标准中间溶液（5.1.15），加入5mL水，涡旋10s后，准确加入20mL提取液（5.1.9），于多管涡旋混匀仪8000r/min离心5min，上清液待净化。8.1.2净化移取上清液10mL于装入净化剂的净化管（5.2.3）中，振荡10min，8000r/min离心5min。移取上层净化液5mL于试管中，置于氮气吹干仪上于45℃以下吹干，加入1.0mL复溶溶液（5.1.11），涡旋复溶，用0.22μm微孔滤膜（5.2.4）过滤，供液相色谱-串联质谱仪测定。8.2基质标准工作溶液的制备称取6份不含被测物的阴性样品5.0g（精确至0.01g不加内标，按照8.1.1和8.1.2的方法提取净化，吹干，加入1.0mL溶剂标准工作溶液（5.1.17），涡旋复溶30s，用微孔滤膜（5.2.4）过滤，供液相色谱-串联质谱仪测定。8.3空白试验除不加试样外，按8.1中描述的步骤做空白实验。8.4仪器分析条件8.4.1液相色谱条件液相色谱参考条件如下：a)色谱柱：C18反相液相色谱柱（2.1mm×100mm,1.7μm）或等效柱；b)柱温：30℃;c)进样量：5μL；d)流动相：A为甲醇（5.1.1），B为0.1%甲酸-5mmol/L乙酸铵水溶液（5.1.10）。梯度洗脱条件见表1。表1液相色谱梯度洗脱条件5500558.4.2质谱条件质谱参考条件如下：4T/BPMA30—2024a)电离源：电喷雾离子源；b)扫描方式：正离子扫描；c)检测方式：多重反应监测（MRM）；d)毛细管电压：0.5kV；e)离子源温度：150℃;f)脱溶剂温度：450℃;g)脱溶剂气流量：650L/h；h)锥孔气流量：50L/h；i)碰撞气体：氩气；j)45种被测物及9种内标物色谱峰的保留时间及质谱参数见附录C。8.5定性判定在相同试验条件下，试样溶液谱图中应呈现定量离子对和定性离子对的色谱峰，被测物质的质量色谱峰保留时间与标准溶液中对应物质的色谱峰保留时间偏差在±2.5%之内；试样色谱图中所选择的监测离子对的相对丰度与相当浓度标准溶液的离子相对丰度比的偏差不超过表2规定范围，则可判断试样中存在对应的被测质。表2定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差±20±308.6定量测定试样溶液和基质标准工作溶液（8.2），注入高效液相色谱-串联质谱联用仪，以被测物浓度为横坐标，以基质标准工作溶液中被测物峰面积与对应内标峰面积比为纵坐标，绘制标准工作曲线，做单点或多点校准。试样溶液与标准溶液中待测物的响应值均应在仪器线性范围内。被测物和内标物标准溶液的特征离子质量色谱图见附录D。如果有阳性检出应采用现行有效的国家标准检测方法进一步确证。9结果计算和表述试样中各被测物含量按照式（1）计算：式中:X——样品中待测组分的含量，单位为微克每千克(μg/kg）；c——从标准曲线计算得到的被测物的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；vf——加入复溶溶液的体积，单位为毫升（mLvt——加入提取液的体积，单位为毫升（mL）；5T/BPMA30—2024vj——移取净化液的体积，单位为毫升（mLm——试样的质量，单位为克（g）；1000——换算系数。计算结果需扣除空白值，测定结果用平行测定的算术平均值表示，保留一位小数。10方法准确度、精密度、检出限和定量限10.1检出限和定量限本方法各被测物的检出限、定量限见附录B。10.2准确度和精密度本方法对鸡肉进行加标回收率实验，不同添加水平下的平均回收率和相对标准偏差数据见附录E。6T/BPMA30—2024表A.1为被测物及内标物中英文名称和CAS号。表A.1被测物及内标物中英文名称和CAS号1C12H18Cl2N2O2C12H18ClNO3bambuterolC18H29N3O54C11H16Cl2N2O5penbuterolC18H29NO26C14H20Cl2N2O7mabuterolC13H18ClF3N2O8brombuterolC12H18Br2N2O9C12H17N3OC11H17NO3C13H21NO3C14H19N3O2ractopamineC18H23NO3C25H37NO4C14H22N2O3propranololC16H21NO2metoprololC15H25NO3C12H11N7C24H32O4SC22H28O3C19H28O2C18H26O2C20H28O2boldenoneC19H26O2C18H22O2C19H26O2prasteroneC19H28O2methyltestosteroneC20H30O27T/BPMA30—2024表A.1被测物及内标物中英文名称和CAS号（续）C20H32O2mestanoloneC20H32O2C21H32N2OC22H29FO5hydrocortisoneC21H30O5prednisoloneC21H28O5C21H28O5prednisoneC21H26O5C24H30F2O6C21H29FO5beclomethasoneC22H29ClO5progesteroneC21H30O2C25H32O4medroxyprogesteroneaceC24H34O4C21H30O3C22H30O3C12H9D9Cl2N2O/C18H19D5ClNO3C13H19D3NO3methyltestosterone-C20H27D3O2testosterone-D3C19H25D3O2boldenone-D3C19H23D3O2progesterone-D9C21H21D9O2C21H27D3O5C22H24D5FO58T/BPMA30—2024本方法被测物和内标物混合标准储备溶液、混合中间溶液分组、配制浓度见表B.1。表B.1混合标准储备溶液和混合标准中间溶液分组、配制浓度和方法的检出限、定量限序号11A21A31A42A51A61A72A81A92A1A1A1A1A1A1A1B1B1B2C2C2C2D2D2D2D2D2D9T/BPMA30—2024表B.1混合标准储备溶液和混合标准中间溶液分组、配制浓度和方法的检出限、定量限（续）储备液2D2D8D2D2D4E4E4E4E4E4E4E4E2F2F2F2F2F1——G—1——G—1——G—2——G—2——G—2——G—2——G—4——G—4——G—T/BPMA30—2024本方法被测物及内标物的保留时间及主要质谱参数的参考值见表C.1。表C.1被测物及内标物的保留时间及主要质谱参数参考值14.78234567894.724.38T/BPMA30—2024表C.1被测物及内标物的保留时间及主要质谱参数（续）4.984.612688T/BPMA30—2024表C.1被测物及内标物的保留时间及主要质谱参数（续）88622424.7564.368T/BPMA30—2024