幽门螺杆菌23S rRNA-gyrA基因突变检测试剂盒（荧光PCR熔解曲线法）（CSZ2400025）

申请人名称：江苏健为诊断科技有限公司 3 3 3 3 4 4 5 9 一、申请人名称江苏健为诊断科技有限公司二、申请人住所泰州市药城大道五期厂房G131号楼2-3层三、生产地址泰州市药城大道五期厂房G131号楼3层一、产品概述生型对照（MC）、Hp-阴性对照（MC）。（具体内容详见产品说明本产品用于定性检测幽门螺杆菌阳性患者正常粪便样本中幽门螺杆菌23SrRNA基因A2142G、A2142C、A2143G突变和gyrA基因本是否存在突变进行判断，不具体区分突变位点。本产品通过检测幽门螺杆菌23SrRNA基因2142、2143位点和gyrA基因87、91号密码子的突变，为临床医生评估个体中幽门螺杆菌的耐药特性提供参考。具体检测的突变位点与耐药类型的关系详见表1可检测的幽门螺杆菌23SrRNA和gyrA基因突变类型基因名称突变位点碱基变化耐药类型23SrRNA2142A2142G克拉霉素耐药2142A2142C2143A2143GgyrAN87IA260T左氧氟沙星耐药N87KC261AT261GD91NG271AD91YG271TD91GA272G48测试/盒本产品采用荧光PCR熔解曲线法，其基本原理为：1）根据耐药基因突变位置上下游序列设计PCR扩增引物，并根据耐药基因突变设计荧光探针；2）通过不对称PCR扩增，生成与荧光探针杂交的单链寡核苷酸序列；3）PCR扩增完成后，在熔解曲线分析过程中实时检测反应体系荧光信号强度的变化，从而绘制反应体系的熔解曲线，并可确定该熔解曲线的熔点（Tm值由此推断该序列的突变信息。二、临床前研究概述1.主要原材料的选择试剂盒主要原材料包括：引物、探针、TaqDNA聚合酶、dNTPs、幽门螺杆菌DNA、293T细胞基因组DNA等。主要原材料均为外购方式获得。引物、探针为申请人自行设计后由专业的合成公司合成。申请人对主要原材料进行了供应商的选择，通过功能性试验，筛选出合格供应商，制定了主要原材料的质量标准2.企业参考品和质控品的设置情况企业参考品包括阳性参考品、阴性参考品、最低检测限参考品、精密度参考品。阳性参考品9份，由突变型幽门螺杆菌菌株、阴性粪便样本组成，涵盖该产品可检出的所有突变型；阴性参考品11份，由特异性评价用菌株/人基因组DNA和野生型幽门螺杆菌的粪便样本组成，涵盖常见的种属相近的或引起症状相似的病原体，及人基因组DNA；最低检测限参考品18份，为检测限浓度样本，由突变型幽门螺杆菌菌株、野生型幽门螺杆菌菌株、阴性粪便样本组成，涵盖该产品可检出的所有突变型；精密度参考品9份，为弱阳性样本，由突变型幽门螺杆菌菌株、阴性粪便样本组成，涵盖该产品可检出的所有突用于检测过程的质量控制。Hp-野生型对照（MC）由幽门螺杆菌野生型菌株DNA、293T细胞基因组DNA、TE缓冲液构成，Hp-阴性对照（二）生产工艺及反应体系研究申请人通过对试剂主要生产工艺的研究，确定了最佳生产工艺。申请人通过对引物浓度、探针浓度、TaqDNA聚合酶浓度、dNTPs浓度、镁离子浓度、PCR反应体系的体积、样本类型、样本采集方式和采集量、样本处理方式、模板加入量、PCR扩增反应程序等条件进行筛选和优化，通过功能性试验，最终确定了最佳的反应体系。（三）分析性能评估本产品分析性能评估内容主要包括：核酸提取试剂性能研究、准确度、精密度、分析特异性、最低检测限等。申请人提交了有效运行的质量管理体系下的试剂批次在适用机型上的性能评估资料。针对核酸提取试剂性能研究，申请人采用临床样本平行比较了三款核酸提取或纯化试剂的提取性能，最终确定了该产品的配套提取试准确度评估中，申请人在适用机型上使用三批试剂盒对若干份临床样本进行检测，检测结果的符合率均为100%。精密度评估中，申请人在适用机型上使用三批试剂盒对中阳性、弱阳性以及阴性样本进行检测，从样本提取开始进行。为期20天的连续检测，从多变量控制来分析本试剂盒的批内、批间、室内、室间、人间等因素对产品精密度的影响。三批试剂盒对临床样本的精密度检测结果均符合要求，批内批间精密度、日内日间精密度、人间精密度、室间精密度CV（%）值≤5%。分析特异性评估中，申请人在适用机型上使用三批试剂盒对具有同源性核酸序列、易引起相同或相似的临床症状、采样部位正常寄生或易并发的其他病原体（空肠弯曲菌、萎缩芽孢杆菌、埃希氏大肠杆菌、阴沟肠杆菌、普通变形杆菌、白色念珠菌、屎肠球菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、乳酸乳球菌、短双歧杆菌、脆弱拟杆菌、具核梭杆菌、海尔曼螺杆菌，粪肠球菌、产气肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌、肠炎沙门氏菌、副溶血弧菌、霍乱弧菌、B族链球菌、小肠耶尔森菌、痢疾志贺氏菌、伤寒沙门菌、甲副伤寒沙门菌、乙副伤寒沙门菌、丙副伤寒沙门菌、鼠伤寒沙门菌、弯曲杆菌、艰难芽孢梭状杆菌、产气荚膜杆菌、蜡样芽孢杆菌、肺炎链球菌、类志贺邻单胞菌、流感嗜血杆菌、脑膜炎奈瑟菌、结核分枝杆菌）进行了验证，检测结果显示人粪便样本中常见的具有潜在交叉反应的病原微生物在医学相关水平处107copies/mL时对本试剂盒检测结果无交叉反应，人基因组DNA在血红蛋白（1000mg/dL）、脂肪（500mg/mL）以及肠道粘液的主要成分MUC2黏蛋白（2000mg/dL）、肠道疾病常见药物盐酸洛哌丁胺胶囊、黄连素、痔疮膏、通便灵胶囊、阿莫西林、克拉霉素、左氧氟沙星、四环素、甲硝唑、奥美拉唑、雷贝拉唑、兰索拉唑、泮托拉唑、枸橼酸铋钾、阿司匹林、对乙酰氨基酚、铝碳酸镁、乳酸菌素、胃康灵）进行了验证，结果显示不高于上述浓度时，对本试剂盒的检测结果没有影响，不会造成假阳性或假阴性。最低检测限研究中，申请人在适用机型上使用三批试剂盒进行了研究。最低检测限研究分为4部分1）单一菌株感染下，各耐药型最低检测限的研究2）单一菌株感染下，各耐药型最低检测限的验证3）复合菌株感染下，不同占比的各耐药型的最低检测限研究；在单一菌株感染下，当幽门螺杆菌基因组不小于200copies/mL时，阳性检出率≥95%。在复合菌株感染下，当突变型菌株占总体菌株的比例大于40%，且突变菌株浓度高于200copies/mL时，阳性检出率≥95%。（四）阳性判断值研究申请人使用该产品对112例临床样本进行相关检测，对样本的Tm值，采用ROC曲线法进行统计分析，初步确定阳性判断值。申请人使用该产品对163例临床样本进行阳性判断值的验证。结果显示阳性符合率、阴性符合率和总符合率均为100%。建立的阳性判断值能准确判断检测结果的阴、阳性。（五）稳定性研究申请人对本产品进行了稳定性研究，包括实时稳定性、使用稳定性、运输稳定性等。研究结果表明：试剂盒在-15℃及以下避光储存，保存期限为12个月。开封后置于-15℃及以下避光储存，可稳定储存至效期末。避免反复冻融（冻融次数不得超过5次）。运输稳定性研究结果支持说明书声称。样本稳定性研究：为考察该产品对不同条件下储存不同时间的样本的检出性能，申请人使用该产品分别对短期储存、长期储存的样本进行测试，研究结果支持说明书声称。三、临床评价概述申请人在南昌大学第一附属医院、南京市第一医院、浙江省中医院、泰州市人民医院共四家临床机构完成了临床试验。临床试验主要第一部分，针对试验用体外诊断试剂用于幽门螺杆菌克拉霉素耐药和左氧氟沙星耐药的辅助诊断用途，采用试验用体外诊断试剂与幽门螺杆菌体外药敏试验（E-test）进行比较研究。与克拉霉素体外药敏试验（E-test）比对研究中共入组1196例病例，其中体外药敏试验检出克拉霉素耐药566例，克拉霉素敏感菌株630例，研究结果显示，试验用体外诊断试剂临床灵敏度是93.64%（95%CI：91.32%~95.37%），临床特异度是88.57%（95%CI：85.85%～90.83%）。与左氧氟沙星体外药敏试验（E-test）比对研究中共入组1166例病例，其中体外药敏试验检出左氧氟沙星耐药菌株536例，左氧氟沙星敏感菌株630例，试验用体外诊断试剂临床灵敏度是87.13%（95%CI：考核试剂与体外药敏试验结果符合率良好。第二部分，采用试验用体外诊断试剂与Sanger测序法进行对比试验。针对23SrRNA基因，共入组病例1309例，其中，测序检出23SrRNA基因的3种常见突变阳性652例，突变阴性657例，两种方法的阳性符合率为97.39%（95%CI：95.86%～98.37%），阴性符合率为95.59%（95%CI：93.73%～96.91%），总符合率为96.49%（95%CI：95.34%～97.36%）。针对gyrA基因，共入组样本1193例，其中，测序检出gyrA基因的6种常见突变阳性524例，突变阴性669例，两种方法的阳性符合率为96.37%（95%CI：94.41%～97.67%），阴性符合93.30%～95.85%）。试验还对所有突变位点进行了单独统计，各位点与Sanger测序法一致性良好。第三部分，采用试验用体外诊断试剂与已上市的幽门螺杆菌核酸检测试剂盒（PCR荧光探针法）进行对比试验，共入组样本497例，其中对比试剂检出阳性303例，阴性194例，两种方法的阳性符合率93.42%～98.58%总符合率为97.18%（95%CI：95.33%～98.31综上所述，临床试验结果显示本产品的临床性能满足技术审评要四、产品受益风险判定根据申请人提供的申报资料，经综合评价，在目前认知水平上，认为该产品的上市为适用人群带来的受益大于风险。但为保证用械安全，基于对主要剩余风险的规避，需要在说明书中提示以下信息：1.本试剂盒的检测结果应结合患者临床诊断结果等情况进行综合分析，不作为患者临床诊治或管理的唯一依据。2.本试剂盒仅针对幽门螺杆菌克拉霉素和左氧氟沙星已知耐药基因（23SrRNA和gyrA）的高频突变类型进行了验证。本品不能用于检测由其他耐药机制或其他耐药基因及基因区域突变引起的耐药。3.本产品结果只对样本是否存在突变进行判断，不具体区分突变4.当样本中幽门螺杆菌含量低于试剂盒检测下限时，可能导致样本检测结果（ROX或FAM通道）不呈现熔解峰，因而无法进行耐药5.当样本中幽门螺杆菌耐药菌株比例低于试剂盒检测下限时，可能导致样本熔解峰与野生型熔解峰一致，样本判定为药物敏感，造成假阴性结果。本申报项目为境内第三类体外诊断试剂产品注册。申请人的注册申报资料符合现行要求，依据《医疗器械监督管理条例》（国务院令第739号）、《体外诊断试剂注册与备案管理办法》（国家市场监督建议准予注册。附件：产品说明书1幽门螺杆菌23SrRNA/gyrA基因突变检测试剂盒（荧光PCR熔解曲线法）说明书通用名称：幽门螺杆菌23SrRNA/gy本产品用于定性检测幽门螺杆菌阳性患者正常粪便样本中幽门螺杆菌幽门螺杆菌感染是胃炎最主要的致病因素，左氧氟沙星对DNA螺旋酶调控DNA拓扑结构功能的抑本产品检测结果仅供临床参考，不应作为治疗药物调整的唯一依据，临床医生应结合患者表1可检测的幽门螺杆菌23SrRNA和gyA2142G2A2142CA2143GN87IA260TN87KA272G）；针（Cy-5）；dNTPs；Mg2+离子；Tris-盐750μL/管×2管核酸提取或纯化试剂（货号：CWY095SE3开封后置于-15℃及以下避光储存，可稳定储存至效期末。避免反样本采集：使用江苏康为世纪生物科技股份有或无其余粪便污染的区域，然后立即取样；打开一次性使用粪便采集保存），41.3.反应体系分装：准备相应数量的PCR管/板，将上述混合反应液震荡30s，快速离心5s，2.2.1充分摇晃混匀含粪便样本的粪便样本采集保存管。将粪便样本采集保存管以5000rpm2.2.2将96孔预装板从试剂盒中取出放入水平离心机3005否1否否否1否是否否1指示内标基因的扩增；对于ABI7500，则运行程序中“QuencherDye”和“PassiveReference”均设置为None。按照样本对应顺序设置Hp-野生型对照(MC)、Hp-6当野生型对照品FAM荧光的Tm值在60℃~68“野生型对照Tm值-2℃”<样本Tm＜“野生型对照Tm值+2℃”“51℃”<样本Tm≤“野生型对照Tm值-2℃”“野生型对照Tm值-2℃”<样本Tm＜“野生型对照Tm值+4℃”“50℃”<样本Tm≤“野生型对照Tm值-2℃”“野生型对照Tm值-2℃”<样本Tm＜“野生型对照Tm值+2℃”对各种分型的幽门螺杆菌阳性粪便样本和阴性粪便样本进行检测后，分析所有幽门螺杆菌2）阴性对照：Cy5通道呈现内标熔解峰，且Tm值在62℃~70℃当荧光定量PCR仪运行结束后，用其配套软件对本次试验的结果进行熔解峰分析，一般情7通过比较待测样本和野生型对照在ROX和FAM通道熔解峰的Tm差异来判断样本是否存在若样本PCR反应ROX通道的熔解峰Tm值在“野生型对照Tm值-2℃”~“野生型对照Tm值+2℃”范围内，则23SrRNA为野生型峰；若样本PCR反应ROX通道的熔解峰Tm值在若样本PCR反应FAM通道的熔解峰Tm值在“野生型对照Tm值-2℃”~“野生型对照Tm值若样本PCR反应Cy5通道的熔解峰Tm值在“野生型对照Tm值-2℃”~“野生型对照Tm值2、图5则该样本为23SrRNA突变型/gyrA突变型，即：克拉霉素耐药/左氧氟沙星耐药；如相差较小时，混合型样本的突变型和野生型熔解峰会“融合”，表现为一个较野生型熔解峰明8）或纯合突变型样本（图9）左右两侧是完全对称的。如果样本左侧明显大于右侧，并且凸起），），8<—样本图123SrRNA野生型图223SrRNA突变型图323SrRNA混合型1.本试剂盒的检测结果应结合患者临床诊断结果等情况进行综合分析，不作为本试剂盒仅针对幽门螺杆菌克拉霉素和左氧氟沙星已知耐药基因（rRNA和gyrA）的高频突变类型进行了验证。本品不能用于检测由其他耐药机制或其他耐药基因及基因区域突变引5.当样本中幽门螺杆菌耐药菌株比例低于试剂盒检测下限时，可能导致样本熔解峰与野生型熔菌、普通变形杆菌、白色念珠菌、屎肠球菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、乳酸乳球菌、短双歧杆菌、脆弱拟杆菌、具核梭杆菌和海尔曼螺杆菌、粪肠球菌、产气肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌、肠炎沙门氏菌、副溶血弧菌、霍乱弧菌、B族链球菌、小肠耶尔森菌、痢疾艰难芽孢梭状杆菌、产气荚膜杆菌菌、蜡样芽孢杆菌、肺炎链球菌、类志贺邻单胞菌、流感嗜经研究发现23SrRNAC2134G突变可能引起克拉霉素耐药的误判。gyrA基因阿司匹林（300.0mg/L）、对乙酰氨基酚（13.824mg/L在4家临床机构完成例临床样本检测，与一代测序法进2.实验室管理应严格按照国家有关分子生实验各阶段应在不同试验区域进行，包括试剂准备区、样本处理区及检测区。每个区的仪器设备不得交叉使用；各区人员流动及空气流向应有严格要求，最大限度避免交叉污染。操作5.请必须使用本说明书中配套的一次性粪便样本采集保存管和核酸提取或纯化试剂盒，不得使6.试剂盒各组分使用前请充分融化并震荡混匀，试剂需离心数秒后使用。加样时应使样品完全加入反应液中，加样后应尽快盖紧管盖或密封封口膜，并适时离心。反应液分装时尽量避免8.操作过程中用到的生物安全柜、移液器、离心机、实时荧光定量PCR仪等仪器设备应经常用10%次氯酸或乙醇及紫外灯交替处理。实验中废弃的吸头应弃于含10%[1]QiuyingH,ZanzanL,Yiqun,.MultiplexFluorescenceMeltingCurveAnalysisforMutationDetectionwithDual-Labeled,-Probes.PLoSOne.[2]