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文档简介

westemblotting步骤及注意事项。一、Westernblotting步骤1.准备样品a.提取细胞或组织蛋白b.蛋白质浓度测定c.蛋白质变性d.蛋白质样品处理2.电泳分离a.准备凝胶b.加载样品c.电泳d.转膜3.洗膜与抗体结合a.洗膜b.一抗孵育c.洗膜d.二抗孵育4.漫射与显影a.漫射b.显影c.定影d.结果分析二、Westernblotting注意事项1.样品处理a.蛋白质提取方法要合适b.避免蛋白质降解c.严格控制蛋白质浓度d.蛋白质变性条件要适宜2.电泳与转膜a.准确配制凝胶b.控制电泳条件c.选择合适的转膜方法d.转膜效果要良好3.抗体与显影a.选择合适的抗体b.控制抗体浓度c.避免抗体交叉反应d.选择合适的显影方法三、Westernblotting常见问题及解决方法1.蛋白质提取问题a.蛋白质提取方法不合适b.试剂质量差c.蛋白质降解d.解决方法：优化提取方法，选择优质试剂，添加蛋白酶抑制剂2.电泳与转膜问题a.凝胶制备不均匀b.电泳条件不合适c.转膜效果差d.解决方法：优化凝胶制备，调整电泳条件，选择合适的转膜方法3.抗体与显影问题a.抗体选择不当b.抗体浓度过高或过低c.抗体交叉反应d.解决方法：选择合适的抗体，优化抗体浓度，避免抗体交叉反应[1]Harlow,E.,&Lane,D.(1988).Antibodies:ALaboratoryManual.ColdSpringHarborLaboratoryPress.[2]Chien,S.T.,&Chien,S.T.(2002).Westernblotting:Astepstepapproach.HumanaPress.[3]Schagger,H.,&vonJagow,G.(1987).Tricinesodiumdodecylsulfatepolyacrylamidegelelectrophoresisfortheseparationofproteinsintherangefrom1to100kDa.AnalBiochem,166(2),368379.[4]Towbin,H.,Staehelin,T.,&Gordon,J.(1979).Electrophoretictransferofproteinsfrompolyacrylamidegelstonitrocellulosesheets:Procedureandsomeapplications.ProcNatlAcadSciUSA,76(9),43504354.[5]Godin

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