生物化学 -第四章 酶

Chapter4

酶(Enzyme)

提纲

第一部分酶通论第二部分酶促反应动力学第三部分酶的作用机制与酶的调节三羧酸循环草酰乙酸柠檬酸异柠檬酸a-酮戊二酸琥珀酸辅酶A琥珀酸延胡索酸苹果酸乙酰辅酶A

生物体内几乎所有的反应都由酶进行催化Section1、酶通论酶学研究史酶的催化作用特点酶的化学本质及其组成酶的分类及命名酶的专一性酶的活力测定和分离纯化核酶、抗体酶和酶工程1783年Spallamzan发现鸟的胃液能消化肉；1814年Kirchhoff发现稀酸对淀粉的加水分解作用【麦芽抽提液加入淀粉后能生成麦芽糖,即麦芽抽提液中必定有能水解淀粉的水溶性物质→ferment(酵素)】1826年Mitscherlich提出水溶性酵素为"unorganizedferment"1830年Kuhle开始使用Enzyme这一术语1833年Payen&Persoz从麦芽抽提液得到了ferment,称diastase【溶于水、稀酸,但不溶于高浓度酒精,即现在的amylase】1835年Berzelius提出ferment起的是催化作用一、酶学研究史1857年Pasteur认为发酵分几个阶段进行,每一步都有特定的酶参与,

但酶只在活体细胞中才能起作用；1894年Bertrand发现了水解酶以外的酶；1897年Buchner兄弟以“没有酵母的酒精发酵”证明了酶可以离开细胞起作用；1910年Halden&Young发现酶是蛋白质与耐热性低分子量化合物

(cofactor)的复合物,提出蛋白质只是担体；1913年米氏方程建立；1926年Sumner得到了Urease的结晶，结晶中测定不到cofactor，

确立了酶是蛋白质的观念；1929年Warburg发现呼吸链诸酶中的血红素

【1935-1936年微生素与辅酶的关系的解明】1929年Sabbarow发现ATP【1939-1940年F.Lipmann解明高能磷酸化合物的生理意义】1959年SutherlandcAMP的发现→酶与激素的关系1970年Restrictionenzyme的发现→基因工程1982年ThomasR.Cech实验发现有催化活性的天然RNA—Ribozyme；范例是L19RNA和核糖核酸酶P的RNA组分具有酶活性两个；

1995年发现DNA也具有催化活性。1986年RichardLerrur和PeterSchaltz运用单克隆抗体技术制备了具有酶活性的抗体（catalyticantibody）-abzyme。1.酶的概念

以蛋白质为主要成分的,具有催化功能的生物催化剂。生物催化剂包括酶（protein)、核酶(DNA或RNA)、抗体酶、生物有机分子等。2.具有一般催化剂的共性自身不参与反应。只催化热力学上允许进行的反应；

ΔG>0,反应不能进行；ΔG<0,反应才能进行。能显著降低反应的活化能，加快反应速度，不改变平衡常数；二、酶的催化作用特点

过氧化氢分解反应

没有催化剂活化能为75.4KJ/mol

液态钯催化剂活化能为Ea=48.9KJ/mol

过氧化氢酶活化能为EaI=8.4KJ/mol活化能：一定温度下1摩尔底物全部进入活化态所需的自由能。3、酶作为生物催化剂的特点（1）反应条件温和酶是生物大分子，高温高压、强酸强碱、重金属盐均容易变性；酶催化反应往往在常温、常压、接近中性酸碱条件下进行；（2）催化效率高酶的催化效率用转换数（Turnovernumber,等于催化常数Kcal）表示，即一定条件下每秒钟每个酶分子转换底物的分子数，一般其Kcal在1s-1到104s-1间；假若酶分子中含有几个催化中心，即指每分子各催化中心所转换的底物分子数之和。反应速度与不加催化剂相比可提高108～1020，与加普通催化剂相比可提高107～1013，如食品在肠胃中消化，唾液淀粉酶稀释100倍还有催化活力；（3）具有高度专一性即酶只能对特定的一种或一类底物起作用，这种专一性是由酶蛋白的立体结构所决定的。绝对专一性，有些酶只作用于一种底物，催化一个反应；相对专一性，这类酶对结构相近的一类底物都有作用。包括键专一性和簇（基团）专一性；立体异构专一性，这类酶只能辨别某一构型的立体异构体，而不催化其他异构体，包括旋光异构专一性和几何异构专一性。（4）酶活性受到调节和控制

酶在细胞内受到精密严格的调节控制。酶浓度调节：诱导或抑制酶的合成（如乳糖操纵子），调节酶的降解；通过激素调节酶活性:激素通过细胞膜或和胞内受体结合引起一系列生物学效应，以此来调节酶的活性。如乳糖酶中调节亚基（它和催化亚基结合组成全酶）受激素控制；反馈抑制调节：生物合成过程涉及多个酶催化反应，第一个合成酶往往受到终端产物抑制，如细菌中的氨基酸、抗生素等的合成；抑制剂和激活剂对酶活性的调节。1、酶的化学本质

除了核酶外，酶绝大部分是蛋白质，或是带有辅因子的蛋白质。生物催化剂包括蛋白酶（protein)、核酶(DNA或RNA)、抗体酶、生物有机分子等。2、酶的组成（1）单纯蛋白质（simpleprotein）：除蛋白外不含其它成分的酶，如脲酶、蛋白酶、淀粉酶、核糖核酸酶等。（2）缀合蛋白质（conjugatedprotein）全酶(holoenzyme）：具有催化活性的酶蛋白，由脱辅酶和辅因子组成；脱辅酶（apoenzyme）：只有与辅因子结合才有催化活性的蛋白亚基辅因子（cofacter)：与脱辅酶结合的对热稳定的非蛋白小分子或金属离子，分为辅酶（coenzyme)和辅基(prostheticgroup)。三、酶的化学本质及其组成3、辅因子

酶的辅因子是酶的对热稳定的非蛋白小分子物质或金属离子，其主要作用是作为电子、原子或某些基团的载体参与反应并促进整个催化过程。辅因子有两类辅酶和辅基，所有辅酶与酶蛋白是非共价结合的，而辅基是共价结合的。传递电子体：如卟啉铁、铁硫簇；传递氢（递氢体）：如FMN/FAD、NAD/NADP、C0Q、硫辛酸；传递酰基体：如C0A、TPP、硫辛酸；传递一碳基团：如四氢叶酸；传递磷酸基：如ATP、GTP；其它作用：转氨基如VB6，传递CO2如生物素。4、单体酶、寡聚酶和多酶复合体(1)单体酶（monomericenzyme）

由一条肽链组成的酶，只有单一的三级结构蛋白质构成。一般为水解酶，其分子量在1-3.5万道尔顿。(2)寡聚酶（oligomericenzyme）

由多个（两个以上）具有三级结构的亚基聚合而成，亚基之间靠次级键结合，分子量在3.5万道尔顿以上，许多寡聚酶是调节酶。(3)多酶复合体(multienzymecomplex)

由几个功能相关的酶嵌合而成的复合体，有利于系列催化反应的进行。如抗生素合成反应中的聚酮合酶PKS.I型聚酮合酶PKS1、分子结构上：各个功能域以融合蛋白形式存在，构成一个个模块；2、催化过程中：各个功能域只催化一步反应；3、最小PKS：KS、AT、ACP是各个模块中必需含有的功能域。纳他霉素合成机理1、酶的命名(1)习惯命名法根据其催化底物或合成产物来命名；根据所催化反应的性质来命名；结合上述两个原则来命名，有时加上酶的来源或其它特点。如琥珀酸脱氢酶、乳酸脱氢酶等（2）国际系统命名法系统名称明确标明底物名称催化反应性质，

若两个底物，中间用“：”隔开（若底物其中一个是水可不表示），最后加一个酶字；四、酶的分类及命名如谷丙转氨酶，系统名称:丙氨酸：

-酮戊二酸氨基转移酶其酶催化的反应:

-酮戊二酸+丙氨酸

谷氨酸+丙酮酸(3)国际系统分类与酶的编号EC(EnzymeCommission)四位数字编号法：用4个阿拉伯数字的编号表示，数字中用“·”隔开，前面冠以EC。数字按反应类型、底物、底物被作用的基团和键，即EC类.亚类.亚亚类.排号；每个酶只能有一个名称和一个编号。葡萄糖氧化酶系统名称为β-D葡萄糖：氧化还原酶葡萄糖氧化酶系统编号为EC1.1.3.4，表示为氧化还原酶（第一位数字）、作用于CHOH（第二位数字）、受体是分子氧（第三位数字）、第四位数字仅表示在亚亚类的位置。2.酶的分类(1)氧化-还原酶（Oxidoreductase）催化氧化-还原反应,主要包括脱氢酶(Dehydrogenase)和氧化酶(Oxidase),如乳酸(Lactate)脱氢酶催化乳酸的脱氢反应。（2）转移酶（Transferase）转移酶催化基团转移反应，即将一个底物分子的基团或原子转移到另一个底物的分子上，例如谷丙转氨酶催化的氨基转移反应。(3)水解酶（Hydrolase）

水解酶催化底物的加水分解反应,包括淀粉酶、蛋白酶、核酸酶及脂酶等，例如脂肪酶(Lipase)催化的脂的水解反应；(4)裂解酶（Lyase）裂合酶催化从底物分子中移去一个基团或原子形成双键的反应及其逆反应，包括醛缩酶、水化酶及脱氨酶等，例如延胡索酸水合酶催化的反应。(5)异构酶（Isomerase）

异构酶催化各种同分异构体的相互转化，即底物分子内基团或原子的重排过程，例如6-磷酸葡萄糖异构酶催化的反应。(6)合成酶（LigaseorSynthetase）合成酶又称为连接酶，能够催化C-C、C-O、C-N以及C-S键的形成反应，这类反应必须与ATP分解反应相互偶联。

A+B+ATP+H-O-H==A-B+ADP+Pi

例如丙酮酸羧化酶催化的反应：丙酮酸+CO2

草酰乙酸

五、酶的专一性1、结构专一性

（1）绝对专一性：只作用于一个底物。与底物结构类似的化合物只能成为竞争性抑制剂或无影响。如脲酶只水解尿素，而不能水解尿素的各种衍生物。（2）相对专一性：作用对象为结构相近的一类底物。基团专一性：对键两端的基团要求程度不同,一个要求严，另一个不严；如凝血酶只水解羧基端为L-精氨酸、氨基端为甘氨酸的肽键。键专一性：只作用于特定的化学键，对键两端的基团无严格要求。如酯酶水解酯键对不同的酯类没有要求，只是水解速率不同。2、立体异构专一性底物的立体构型影响酶和底物的结合与催化。（1）旋光异构专一性：当底物具有旋光异构体时，酶只作用于其中的一种。如精氨酸酶只能催化L-精氨酸水解,对D-精氨酸则无作用,这种立体异构专一性是由于酶活性中心与相应底物的结合必须是二者在构型或构象上彼此匹配才能建立。（2）几何异构专一性：当底物具有顺反几何异构体时，酶只作用于其中的一种。延胡索酸(反丁烯二酸)L(+)苹果酸3、酶的活性中心（activecenter）

（1）概念酶分子中直接和底物结合并起催化反应的空间局限，分为结合部位和催化部位，总称为酶的活性中心；对不需辅酶的酶，活性中心就是酶分子在三维结构上较靠近的少数几个氨基酸残基或这些残基上的某些基团，它们在一级结构上可能相距甚远，甚至位于不同肽链上，通过肽链的盘绕折叠在空间构象上相互靠近；对需要辅酶的酶，辅酶分子或其某一部分往往就是活性中心的组成部分。（2）活性中心的组成

酶的活性中心分为结合部位和催化部位结合部位(Bindingsite)

酶分子中与底物结合的区域称为结合部位，一般由1-数个aa组成，结合部位决定酶专一性；催化部位(Catalyticsite)

酶分子中促使底物发生化学变化的区域称为催化部位，催化部位决定酶所催化反应的性质。胰凝乳蛋白酶调控部位(Regulatorysite)

酶分子中存在着一些可以与其他分子发生某种程度的结合的部位，从而引起酶分子空间构象的变化，对酶起激活或抑制作用。必须基团：酶表现催化活性不可缺少的基团。亲核性基团：丝氨酸的羟基、半胱氨酸的巯基和组氨酸的咪唑基。酸碱性基团：天冬氨酸和谷氨酸的羧基、赖氨酸的氨基、酪氨酸的酚羟基、组氨酸的咪唑基和半胱氨酸的巯基等。亲核性基团酸碱性基团胰凝乳蛋白酶

（3）酶活性中心的特点活性部位在酶分子的总体中只占相当小的部分，往往只由几个氨基酸残基组成；酶的活性部位是一个三维实体：活性部位的三维结构是由酶的一级结构所决定的。活性部位的氨基酸残基在一级结构上可能相距甚远，但在肽链的盘绕、折叠而在空间结构上相互靠近；酶活性部位是一个疏水区域：酶的活性部位是位于酶分子表面的一个裂缝内，这是相当疏水的区域，非极性基团较多，产生一个微环境，提高与底物的结合能力；而其内少量的极性氨基酸残基可与底物结合而发生催化作用；底物通过次级键较弱的力结合到酶上：酶与底物结合成ES复合物主要靠次级键：氢键、盐键、范德华力和疏水相互作用；酶活性部位具有柔性或可运动性。4、酶作用专一性的假说

（1）锁与钥匙学说

1894年EmilFisher提出，认为底物分子或其中的部分专一地楔入到酶的活性中心部位，即底物分子的化学部位与酶分子催化基团间有紧密互补的关系。如何解释可逆反应？

（2）三点附着学说

认为立体对映的一对底物虽然基团相同，但空间排列不同，这样就存在这些基团与酶分子活性中心的结合基团是否匹配的问题，只有三点都互补匹配时，酶才作用于这个底物。（3）诱导楔合学说

1958年Koshland提出，认为当酶分子与底物分子接近时，酶蛋白受底物分子的诱导，其构象发生有利于底物结合的变化，酶与底物在此基础上互补楔合，引发催化反应。己糖激酶hexokinase与底物结合前后的构象变化六、酶的活力测定和分离纯化（一）酶的活力测定1、基本概念（1）酶活力：酶催化一定化学反应的能力称为酶活力，又称为酶活性，通常以一定条件下酶所催化的化学反应速度来表示。（2）基本原理:对酶的测定不是直接测定其酶蛋白的浓度，而是测定其催化化学反应的能力，这是基于在最优化条件下，当底物足够（过量），在酶促反应的初始阶段，酶促反应的速度（初速度）与酶的浓度成正比（即V=K［E］），故酶活力测定的是化学反应速度，一定条件下可代表酶活性分子浓度。2、酶活力测定一定量的酶在单位时间内产物(P)的生成（增加）量或底物（S）的消耗（减少）量，即测定时确定三种量①加入一定量的酶，②一定时间间隔，③物质的增减量。（1）酶活力测定的内容酶反应初速度测定：在一个反应体系中，当底物量充足时，加入一定量的酶液，开始计时反应，经一定时间反应后，终止反应，测定在这一时间间隔内发生的化学反应量（终止时与起始时的浓度差）；酶反应平均速度测定：在一定条件下，加入一定量底物（规定），再加入合适量的酶液，测定完成该反应（底物反应完）所需的时间；动态连续测定法：在反应体系中，加入酶，用仪器连续监测整个酶促反应过程中底物的消耗或产物的生成。快速反应追踪法：近年来，追踪极短时间（10-3s以下）内反应过程的方法和装置已经应用，其代表有停流法（stopped-flow）和温度跃变法（temperaturejump）。（2）酶反应条件优化酶活测定的反应条件应该是最适条件，所谓最适条件包括最适温度、最适pH、足够大的底物浓度、适宜的离子强度、适当稀释的酶液及严格的反应时间，抑制剂不可有，辅助因子不可缺。（3）酶活力测定方法反应计时：反应计时必须准确，反应体系必须预热至规定温度后，加入酶液并立即计时；反应到时，立即灭酶活性，终止反应，并记录终了时间；终止酶反应，常使酶立刻变性，最常用的方法是加入三氯乙酸或过氯酸使酶蛋白沉淀，也可用SDS使酶变性，或迅速加热使酶变性。有些酶可用非变性法来停止反应或用破坏其辅因子来停止反应。反应量的测定：可测底物减少量或产物生成量，在反应过程中产物是从无到有，变化量明显，极利于测定，所以大都测定产物的生成量。具体物质量通过定量分析法测定，常用的方法有：

光谱分析法：酶将产物转变为（直接或间接）一个可用分光光度法或荧光光度法测出的化合物。

化学法：利用化学反应使产物变成一个可用某种物理方法测出的化合物，然后再反过来算出酶的活性。

放射性化学法：用同位素标记的底物，经酶作用后生成含放射性的产物，在一定时间内，生成的放射性产物量与酶活性成正比。（4）酶活力测定举例：福林-酚法测定蛋白酶活力，原理是以酪蛋白为底物进行反应，用福林-酚试剂显色，并用光度法测定反应产物酪氨酸的生成量。对反应初期进行测定，为初速度法。

3.酶活力单位（activityunit）酶活力的大小即酶含量的多少，用酶活力单位表示，即酶单位（U）.(1)酶活力单位定义：一定条件下一定时间内将一定量的底物转化为产物所需的酶量。因此酶的含量可以用U/g或U/ml表示。（2）国际单位U（Unit）：最适反应条件下（如25Cº），每分钟转化1μmol底物转化为产物所需的酶量定为一个酶活力单位；以上的酶单位定义中，如果底物（S）有一个以上可被作用的化学键，则一个酶单位表示1分钟使1μmol有关基团转化的酶量。如果是两个相同的分子参加反应，则每分钟催化2μmol底物转化的酶量称为一个酶单位。Kat单位：最适反应条件下（25Cº），每秒钟转化1mol底物所需的酶量。Kat和U的换算关系：1Kat=6×107U，1U=1U=16.67nmol.s-1=16.67nKat；在“U”和“kat”酶活力单位的定义和应用中，酶催化底物的分子量必须是已知的，否则将无法计算。（3）习惯单位

实际使用中，常采用方便、直观，规定的酶活力单位α-淀粉酶：规定条件下，每小时分解1g可溶性淀粉的酶量为一个酶单位；糖化酶活力单位：规定条件下，每小时转化可溶性淀粉产生1mg还原糖（以葡萄糖计）所需的酶量为一个糖化酶单位。蛋白酶：规定条件下，每分钟分解底物酪蛋白产生1μg酪氨酸所需的酶量。DNA限制性内切酶：推荐反应条件下，1小时内可完全消化1μg纯化的DNA所需的酶量。4、比活力（specificactivity）酶的比活力：每单位（一般是mg）蛋白中的酶活力单位数（如：U/mg蛋白）；实际应用中也用每单位制剂中含有的酶活力数表示,如U/mL（液体制剂)、U/g（固体制剂）；比活力是评价酶纯度高低的一个指标，对同一种酶来讲，比活力愈高则表示酶的纯度越高（含杂质越少）。（二）酶的分离纯化1、基本原则提取过程中避免酶变性而失去活性，防止强酸、强碱、高温和剧烈搅拌等；要求在低温下操作，加入的化学试剂不使酶变性，操作中加入缓冲溶液。

2、基本操作程序（1）选材：微生物（微生物发酵物:胞内酶、胞外酶），动物（动物器脏：消化酶，血液：SOD酶，尿液：尿激酶等）,植物（木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶等）;（2）破碎：胞内酶先要进行细胞破碎，采用机械研磨、超声波破碎、反复冻融或自溶等；（3）抽提：在低温下，以水或低盐缓冲液，从组织匀浆中提取酶，得到粗酶液；

（4）分离：先进行净化处理（过滤，絮凝，离心脱色），再采用沉淀法分离（盐析法，有机溶剂沉淀法，超离心等）;

（5）纯化：可采用离子交换层析，凝胶电泳，液相色谱、亲和色谱和超滤等方法。（6）结晶（7）保藏：酶粉在低温下可较长时间保存。3、酶分离纯化操作的评价回收率=每次总活力/第一次总活力总活力=比活力×总体积（总重量）纯化倍数=每次比活力/第一次比活力3、酶的制剂形式（1）固体：干燥（冰冻升华，喷雾干燥，真空干燥）;

（2）载体吸附;

（3）液体。

【例题】一位生化专业的研究生对酶进行分离纯化得到以下数据,请回答:(1)这六步分离纯化过程，哪一步分离效果最好，哪一步最差？(2)该酶是否已经纯化，还可以用什么方法确定其是否纯化？编号分离步骤总蛋白含量（mg）活力单位数（U）1粗分离2000040000002盐析500030000003等电点分离400010000004离子交换2009000005亲和层析507500006分子筛层析45675000【解答】(1)这六步的比活力与回收率见下表，可见亲和层析效果最好，等电点分离效果最差(2)该酶一纯化，因为分子筛已不能提高酶活力了。还可以用聚丙烯酰胺电泳进行酶蛋白的纯度鉴定。编号分离步骤比活力（U/mg）回收率（%）1粗分离2001002盐析600753等电点分离250254离子交换450022.55亲和层析1500018.756分子筛层析1500016.88七、核酶、抗体酶和酶工程1、核酶：具有催化作用的RNA分子。种类：催化分子内反应的核酶，如自我剪接和自我剪切；催化分子间反应的核酶；化学属性：核酶的本质属性是核酸，不是蛋白质意义：根据RNA的发夹或锤头状结构原理，可以设计各种人工核酶，用作抗病毒和抗肿瘤的防治药物2、抗体酶：具有催化能力的蛋白质，本质上是免疫球蛋白，但在易变区赋予了酶的特性。根据酶催化的过渡态理论，可以设计各种过渡态类似物作为半抗原免疫动物（如鼠、兔），筛选具有催化活性的单抗。

3、酶工程（1）化学酶工程：指天然酶、化学修饰酶、固定化酶和人工模拟酶的研究与应用。化学修饰酶：通过对酶分子表面进行修饰（如交联反应、大分子修饰酶蛋白侧链），或对酶分子的内部功能基团进行修饰，获得性能改善的酶。人工模拟酶：模拟酶的生物催化功能，用化学合成（或半合成）的人工催化剂固定化酶：通过吸附、耦联、交联和包埋等理化方法把酶连接到某种载体上，制成仍具有酶催化活性的水不溶性酶。固定化酶具有高稳定性、易分离、可反复使用、高机械强度等特点。（2）生物酶工程：利用基因技术大量生产酶、产生遗传修饰酶（突变酶）、构建新酶（自然界没有）的生物技术（3）固定化酶的固定化方法吸附法（Adsorption）：把酶吸附于惰性载体上或吸附于离子交换树脂上，利用酶和载体间的非特异性物理吸附或特异吸附作用将酶固定到载体表面。包埋法（Entrapment）：利用高分子物理截留作用将酶限制在聚合网络中的方法，主要是依靠物理作用，个别也存在化学键作用，主要有凝胶包埋法、纤维包埋法、微囊化包埋法等。交联法（Cross－linking）：利用醛类、胺类和水合金属氧化物等具有双功能或多功能基团的交联剂与酶之间以共价键交联形成不溶性大分子而加以固定化的方法。共价结合法（Covalentattachment）：利用酶蛋白质上非生物活性部位的功能基团（如氨基、羧基、酪氨酸的苯环、半胱氨酸的巯基、组氨酸的咪唑基、色氨酸的吲哚基及丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸的羟基等）与经过化学修饰而活化的载体之间通过共价键结合的方法。该方法的特点是结合力强，不易脱落，热稳定性强；但是缺点是操作复杂，反应条件不易控制，酶活性损失较大。定向固定法：把酶和载体在酶的特定位点上连接起来，使酶在载体表面按一定的方向排列，使它的活性位点面朝固体表面的外侧排列，有利于底物进入到酶的活性位点，能够显著提高固定化酶的活性，比随意固定化酶的方法具有很大的优越性。包括酶和抗体的亲和连接、酶通过糖基固定、酶和金属离子连接固定等。内容提要1、术语解释：酶、全酶、脱辅基酶蛋白；辅因子、辅酶、辅基；单体酶、寡聚酶、多酶复合体；核酶、抗体酶、固定化酶、人工模拟酶；酶活力、酶活力单位、比活。2、酶是生物催化剂，除某些RNA外酶是蛋白质或是带有辅助因子的蛋白质。酶具有一般催化剂的性质，可以通过降低活化能来提高反应速度，使反应快速达到平衡点，但不能改变平衡点。3、酶的显著特点是反应条件温和、催化效率高、具有高度的催化专一性和易受多种因素的影响和调控。4、酶的化学组成可分为单纯蛋白和缀合蛋白，缀合蛋白由不能单独表现酶活性的脱辅基酶蛋白和辅因子组成；脱辅基酶蛋白决定酶催化专一性，辅因子在催化反应中起传递电子、原子或某些化学基团的作用；辅因子中辅酶与脱辅基酶蛋白费共价结合、辅基与酶蛋白共价结合。5、酶可以按照催化反应的类型，分外脱氢酶、转移酶、水解酶、裂解酶、异构酶和合成酶（连接酶）；每种酶都有一个习惯名称和国际系统名称，并且有一个编号。6、酶的活性部位是一个三维结构的疏水裂隙，除含有疏水氨基酸残基，还含少量的极性氨基酸残基，极性氨基酸残基常参与催化反应。酶活性部位的可离子化和可反应的氨基酸残基形成酶的催化中心。诱导楔合学说可以解释酶的催化反应机制。7、酶的专一性分为相对专一性、绝对专一性和立体异构专一性，其中相对专一性又分为基团专一性和键专一性，立体异构专一性又分为旋光专一性、几何构型专一性。8、酶的活力就是酶催化反应的能力，酶活力单位用于表示酶的含量或活力的一种量度；比活是每克酶蛋白所具有的酶活力单位数，比活测定是酶纯化的监测指标，对同一种酶而言，比活越大，酶的纯度越高。习题1、简单阐述酶和无机催化剂的异同点，并说明核酶、抗体酶和普通酶的区别。2、称取25mg酶制剂配制25ml酶溶液，从中取出0.1ml酶溶液，以酪蛋白为底物，用福林酚-比色法测定酶活力，得知1小时产生1500μg的酪氨酸；另取2ml酶溶液用凯氏定氮法测得蛋白氮为0.2mg。若以产生1μg/ml酪氨酸的酶量为1个活力单位，请计算：（1）1ml酶溶液所含蛋白质量和酶活力单位；（2）酶溶液的比活力；（3）1g酶制剂的总蛋白含量和总活力。3、从肝细胞中提取一种水解酶的粗提液300ml含150mg蛋白质，总活力为360单位。经过系列纯化得到4ml酶制剂（含0.08mg蛋白），总活力为288单位，整个纯化过程收率是多少？纯化了多少倍？答案2、（1）1ml酶溶液含0.625mg蛋白质,酶活力单位为250单位；（2）酶溶液的比活力400单位/mg;

（3）1g酶制剂的总蛋白含量为0.625mg和总活力2.5×105单位.3、纯化过程收率为80%，纯化了1500倍。Section2酶促反应动力学

浓度对酶反应速率的影响抑制剂对酶反应速率的影响温度对酶反应速率的影响pH对酶反应速率的影响激活剂对酶反应速率的影响酶促反应动力学的推导方法一、底物浓度对酶反应速度的影响1、中间络合物学说酶与底物先络合成一个过渡态络合物，然后络合物进一步分解为产物和游离态酶。这个学说的前提是酶与底物反应的“快速平衡”，即在反应的开始阶段，两者反应速度很快，迅速建立平衡关系。

第一步：酶（E）与底物（S）作用，形成酶-底物中间产物（ES）：E+S←→ES(k1和k2是正、逆反应的速度常数)

第二步：中间产物分解，形成产物（P），释放出游离酶(E)：

ES←→P+E

实验证明了E－S复合物的存在，E－S复合物形成的速率与酶和底物的性质有关。K1K2K3活化能：一定温度下1摩尔底物全部进入活化态所需的自由能，Ea=Pa-Pe。自由能：ΔG=Pp-Pe<0过渡态络合物ES反应物S产物P2、底物对酶促反应的影响在酶浓度、pH、温度等条件不变的情况下，一级反应：当低底物浓度时，反应速度与底物浓度呈正比；混合级反应：随底物浓度增加，反应速度不再按正比升高；零级反应：继续增大底物浓度，反应速度递增为零，这时反应速度已趋向一个极限，说明酶已被底物饱和。

3、酶促反应动力学（1）米氏方程

1913年，德国化学家Michaelis和Menten根据中间络合物学说对酶促反应的动力学进行研究，推导出了表示整个反应中底物浓度和反应速度关系的著名公式，称为米氏方程。Km

—

米氏常数Vmax

—

最大反应速度简单起见，只考虑单底物和单产物的催化反应:反应初期，[P]的浓度非常低，因此整个反应可简化为:（2）米氏方程的推导(Michaelis-Menten)

根据中间络合物学说，酶促反应分两步进行:K2

K3

K3

K2

整个酶促反应中，反应的限速步骤为[ES]分解生成[E]和[P]的过程，因此反应的初速度可以表示为反应过程中，游离的酶浓度可以表示为反应过程中，底物浓度[S]是远远高于酶浓度的[Et]，即[S]>>[Et],所以游离的底物浓度可以用[S]计算。V=k3[ES][Et]=[E]+[ES]

，其中Et为酶的总浓度

（3）米氏常数Km的意义由米氏方程可知，当反应速度等于最大反应速度一半时,即V=1/2Vmax,Km=[S]

米氏常数是反应速度为最大值的一半时的底物浓度，米氏常数的单位为mol/L。Km值表示酶与底物之间的亲和程度。Km值大表示亲和程度小，酶的催化活性低;Km值小表示亲和程度大,酶的催化活性高；Km值只是在固定的底物，一定的温度和pH条件下，一定的缓冲体系中测定的，不同条件下具有不同的Km值；不同的酶具有不同Km值，它是酶的一个重要的特征物理常数。（4）米氏常数Km的测定

测定Km和V的方法很多，最常用的是Lineweaver–Burk的作图法—双倒数作图法。取米氏方程式的倒数形式，以底物浓度倒数对反应速度倒数作图，得到方程，就可解出Vmax和Km。

1Km11

=

+

V

Vmax[S]Vmax1/Vmax斜率=Km/Vmax-1/Km【例题1】对于一个遵循米氏动力学的酶，（1）当[S]=Km时，V=35μmol/min,求Vmax？（2）当[S]=2×10-5M，V=40μmol/min

时，求Km?【解】

(1)

Vmax=V（Km+[S]）/[S]=35([S]+[S])/[S]=70(μmol/min)(2)Km=Vmax[S]/V-[S]=70×2×10-5/40-2×10-5

=1.5×10-5M

4、多底物酶促反应动力学

大多数酶反应包含一种以上的底物：A+B→P+Q依次反应机理（需要NAD+或NADH+的脱氢酶的反应属于这类型）：

BPE+AEAEABEPQEQE+Q

2)随机机理：

E+A←→EABQEP←→E+PEAB←→EPQE+B←→EBAPEQ←→E+Q3)乒乓反应机理（转氨酶的反应属于这类型）

：

APBQEE两种不同模式的双底物反应顺次式(sequential)乒乓式(ping-pong)双底物反应的米氏方程当P1,P2=0时二、抑制剂对酶反应的影响1、酶的抑制作用有些物质与酶分子上某些必须基团结合（作用),使酶的活性中心的化学性质发生改变，导致酶活力下降或丧失，这种现象称为酶抑制作用。能够引起酶的抑制作用的化合物则称为抑制剂（inhibitor);酶的抑制剂一般具备两个方面的特点：化学结构上与被抑制的底物分子或底物的过渡状态相似；能够与酶的活性中心以非共价或共价的方式形成比较稳定的复合体或结合物。2、抑制作用的类型根据酶活性变化可分为可逆与不可逆二类

不可逆抑制作用：抑制剂与酶反应中心的活性基团以共价形式结合，引起酶的永久性失活。如有机磷毒剂二异丙基氟磷酸酯。

可逆抑制作用：抑制剂与酶蛋白以非共价方式结合，引起酶活性暂时性丧失。抑制剂可以通过透析等方法被除去，并且能部分或全部恢复酶的活性。根椐可逆抑制剂与酶结合情况可分为竞争性抑制、非竞争性抑制与反竞争性抑制三类。3、竞争性抑制抑制剂的化学结构与底物相似，因而能与底物竟争与酶活性中心结合。当抑制剂与活性中心结合后，底物被排斥在反应中心之外，其结果是酶促反应被抑制了。竟争性抑制通常可以通过增大底物浓度，提高底物浓度可以降低抑制作用。竞争性抑制可用下式表示：草酸盐草酰乙酸盐丙二酸戊二酸

竞争性抑制剂存在时，Km值增大(1+[I]/Ki)倍，且Km值随[I]的增高而增大；[E]固定时，当[S]﹥﹥Km(1+[I]/Ki),Km(1+[I]/Ki)项可忽略不计，则v=Vmax，即最大反应速度不变。竞争性抑制作用的速度方程竞争性抑制作用的Lineweaver–Burk图4、非竞争性抑制抑制剂不是与底物竞争与活性中心的结合，称为非竞争性抑制。

酶同时与底物及抑制剂结合，引起酶分子构象变化，导至酶活性下降。如某些金属离子（Cu2+、Ag+、Hg2+）以及EDTA等，通常能与酶分子的调控部位中的-SH基团作用，改变酶的空间构象，引起非竞争性抑制；不能通过增大底物浓度的方法来解除抑制作用；反应过程中有三元复合物存在。非竞争性抑制可用下式表示：非竞争性抑制剂存在时，V值减小(1+[I]/Ki)倍，且V值随[I]的增高而降低；但Km值不变。非竞争性抑制作用的速度方程非竞争性抑制作用的Lineweaver–Burk图

反竞争性抑制剂存在时，Km和V值均减小(1+[I]/Ki)倍，且都随[I]的增高而降低。5、反竞争性抑制酶只有在与底物结合后，才能与抑制剂结合，引起酶活性下降。反竞争性抑制可用下式表示：反竞争性抑制作用的速度方程反竞争性抑制作用的Lineweaver–Burk图I竞争性抑制反竞争性抑制非竞争性抑制竞争性抑制不改变Vmax，非竞争性抑制不改变Km，反竞争性抑制两者均发生变化；总结竞争性抑制：非竞争性抑制：反竞争性抑制：竞争性抑制改变横截距（Km

变大），非竞争性抑制改变纵截距（Vmax

变小）；反竞争性抑制，Km和

Vmax

值均减小。【例题2】假设浓度为2×10-5mol/L的某抑制剂抑制了一个酶催化反应的75%，求这个非竞争性抑制的Ki?【解】

已知:[I]=2×10-5mol/L，V’max/Vmax=0.25

V’max/Vmax=1/(1+[I]/Ki)=1/(1+2×10-5/Ki)=0.25

所以:Ki=6.7×10-5mol/L

三、温度对酶反应的影响

1、酶的最适温度：酶达到最大反应速度时的温度最适温度是酶的特征之一，但不是一个特征常数，它与反应时间、溶液的离子强度、缓冲溶液种类有关最适温度2、温度对酶促反应的影响温度升高,酶促反应速度加快；另一方面,温度升高,酶的高级结构将发生变化或变性，导致酶活性降低甚至丧失。因此酶的最适合温度是二者平衡的结果.3、大部分酶在60Cº以上失活变性。一般动物酶的最适温度在35-40Cº，植物酶的最适温度在40-50Cº。少数酶能耐受高温，如细菌耐高温淀粉酶在93Cº时活力最大，牛胰核糖核酸酶在100Cº时仍不失活。4、酶在干燥情况下比在潮湿情况下耐受的温度高，这一点可用于酶的保存。四、pH对酶反应的影响1、最适pH：酶具有最大的催化活性，酶促反应速度达到最大时的溶液pH。2、pH对酶活力的影响影响酶活性中心基团的解离影响底物某些基团的解离影响酶蛋白空间构象，甚至失活3、最适pH是酶的特征之一，但不是一个特征常数，它与底物种类、浓度和缓冲溶液成分有关，而且与酶的等电点不一致.五、酶浓度对酶反应的影响1、在底物足够过量而其它条件固定的情况下，并且反应系统中不含有抑制酶活性的物质及其他不利于酶发挥作用的因素，酶促反应的速度和酶浓度成正比。2、有时出现酶浓度增大，反应速度反而下降的现象，这是由于酶纯度不够，含有抑制酶活性的物质。六、激活剂对酶作用的影响1、激活剂凡是能提高酶活力的简单化合物都称为激活剂（activator)，大部分是一些无机离子和小分子简单有机物。如：Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Cu2+、Zn2+、Co2+、Cr2+、Fe2+、Cl-、Br-、I-、CN-、NO3-、PO4-等；2、激活剂的激活作用具有相对性

一般情况下，一种激活剂对某种酶是激活剂，而对另一种酶则起抑制作用；对于同一种酶，不同激活剂浓度会产生不同的作用，浓度过大甚至会出现抑制作用。3、作用机理（1）离子激活剂：可与酶分子上的氨基酸侧链基团结合，可能是酶活性部位的组成部分，也可能作为辅酶或辅基的一个组成部分起作用；（2）小分子激活剂：如巯基乙醇、半胱氨酸主要是饱和酶分子中的巯基；（3）螯合剂EDTA：解除某些重金属离子对酶的抑制作用。（一）快速平衡法1、酶和底物首先形成复合物，快速达到平衡，随后才转化为产物。2、推导假设[S]》[E]V=dp/dt|t=0=

ds/dt|t=0等温条件下、稳定pH（缓冲溶液中）单底物反应不考虑酶的失活六、酶促反应动力学方程的推导3、推导过程解离常数：

Km=K-1/K1=[S][E]/[ES]决速步反应：

V=dp/dt=K2[ES]总酶浓度：[Et]=[E]+[ES]所以：Km=[S]（[Et]-[ES]）/[ES][ES]=[S][Et]/（Km+[S]）

V=K2[ES]=K2[S][Et]/（Km+[S]）故：V=Vmax[S]/（Km+[S]）

这就是著名的米氏方程

Vmax=K2[Et],Km=K-1/K1内容提要1、术语解释：米氏常数、竞争性抑制、非竞争性抑制、反竞争性抑制；酶的最适温度、酶的最适pH、激活剂；2、酶动力学的测定常常是测定反应的起始速度，酶促反应的第一步是形成酶-底络合物。在反应起始时，酶促反应对酶浓度时一级反应，相对于底物浓度的变化表现为典型的双曲线特征，当酶被底物饱和时达到最大反应速度Vmax,3、米氏方程描述酶动力学行为。米氏常数Km等于反应速度一半时的底物浓度，Km是酶的特征常数。Km是酶对底物亲和力的量度，Km越少，表明酶对底物的亲和力越大。4、酶促反应受到抑制剂的影响。酶抑制剂可分为可逆抑制和不可逆抑制，可逆抑制剂与酶非共价结合，不可逆抑制剂与酶活性部位的功能基团共价结合。5、可逆抑制可分为竞争性抑制、非竞争性抑制和反竞争性抑制。竞争性抑制不改变Vmax、Km变大，非竞争性抑制不改变Km、Vmax变小，反竞争性抑制，Km和Vmax值均减小。6、酶促反应受pH和温度的影响，大多数酶都存在一个最适pH和最适温度，在最适pH和最适温度下，酶促反应具有最大的反应速度，但最适pH和最适温度都不是酶的特征常数。大多数酶的反应速度-pH以及反应速度-温度曲线是钟形曲线。习题1、请推导米氏动力学方程2、一个遵循米氏动力学酶的Km为3.0

mol/L，问酶活性部位被底物饱和的分数分别为10%、50%、90%时，底物浓度分别为多少？3、某酶的Km为4.7×10-5mol/L，最大反应速度为22μmol/min，底物浓度为2×10-4mol/L，计算（1）当竞争性抑制剂浓度为5×10-4mol/L、非竞争性抑制剂浓度亦为5×10-4mol/L时，Ki均为3×10-4mol/L时酶的催化反应速度？（2）上述两种情况抑制的百分比是多少？答案2、（1）V=10%Vmax

则：10%=[s]/([s]+Km)，[S]=Km/9=3.0/9=0.33mol/L(2)V=50%Vmax,[S]=Km=3.0mol/L(3)V=90%Vmax,同法得：[S]=9Km=27mol/L3、（1）当竞争性抑制剂浓度为5×10-4mol/L时

V1=Vmax·[s]/(km(1+[I]/ki)+[S])=13.5μmol/L·min

（2）当非竞争性抑制剂浓度为3×10-4mol/L时

V2=Vmax·[s]/(km+[S])(1+[I]/ki)=6.68μmol/L·min

（3）没有抑制剂时的酶催化速度

V=Vmax·[s]/(km+[S])=17.8μmol/L·min

故：竞争性抑制的抑制百分比=1-V1/V=24%

非竞争性抑制的抑制百分比=1-V2/V=62.5%答案2、（1）V=10%Vmax

则：10%=[s]/([s]+Km)，[S]=Km/9=3.0/9=0.33mol/L(2)V=50%Vmax,[S]=Km=3.0mol/L(3)V=90%Vmax,同法得：[S]=9Km=27mol/L3、（1）当竞争性抑制剂浓度为5×10-4mol/L时

V1=Vmax·[s]/(km(1+[I]/ki)+[S])=13.5μmol/L·min

（2）当非竞争性抑制剂浓度为3×10-4mol/L时

V2=Vmax·[s]/(km+[S])(1+[I]/ki)=6.68μmol/L·min

（3）没有抑制剂时的酶催化速度

V=Vmax·[s]/(km+[S])=17.8μmol/L·min

故：竞争性抑制的抑制百分比=1-V1/V=24%

非竞争性抑制的抑制百分比=1-V2/V=62.5%Section3、酶作用机制和酶的调节酶的活性中心影响酶催化效率的因素酶催化反应机制的实例酶的活性调节同工酶和多酶体系一、酶的活性中心（activecenter）

1、概念对于不需要辅酶的酶来说，活性中心就是酶分子在三维结构上比较靠近的少数几个氨基酸残基或是这些残基上的某些基团，它们在一级结构上可能相距甚远，甚至位于不同的肽链上，通过肽链的盘绕，折叠而在空间构象上相互靠近；对于需要辅酶的酶来说，辅酶分子或其某一部分往往就是活性中心的组成部分。2、活性中心的功能部位结合部位：一定的底物靠此部位结合到酶分子上；催化部位：底物的键在此部位被打断或形成新的键，从而发生一定的化学变化。

3、酶活性部位的特点活性部位在酶分子的总体中只占相当小的部分：往往只由几个氨基酸残基组成；酶的活性部位是一个三维实体：活性部位的三维结构是由酶的一级结构所决定的。活性部位的氨基酸残基在一级结构上可能相距甚远，但在肽链的盘绕、折叠而在空间结构上相互靠近；酶活性部位是一个疏水区域：酶的活性部位是位于酶分子表面的一个裂缝，这是相当疏水的区域，非极性基团较多，产生一个微环境，此裂缝内的底物浓度相当高，从而提高了与底物的结合能力；而其内少量的极性氨基酸残基可与底物结合而发生催化作用；诱导契合是一个动态的辨认过程：酶的活性部位与底物结合中，酶与底物的构象发生变化后互补，即诱导契合是一个动态的辨认过程。底物通过次级键较弱的力结合到酶上：酶与底物结合成ES复合物，主要作用力为次级键（氢键、盐键、范德华力和疏水相互作用）；酶活性部位具有柔性或可运动性。二、影响酶催化效率的因素1、酶与底物的临近效应与定向效应（1）临近效应指两个反应的分子，它们反应的基团需互相靠近，才能反应。酶促反应速度与底物浓度成正比，底物与酶活性中心的靠近，提高活性中心的底物有效浓度，从而大大提高酶促反应速度。（2）定向效应指酶的催化基团与底物的反应基团之间的正确定向。当底物与活性中心结合时，酶蛋白经诱导而发生构象变化，底物反应部位（基团或键）与酶的催化部位发生楔合，即“定向”作用，使酶促反应具有高效率和专一性特点。2、底物的形变和诱导契合

底物与酶结合诱导酶的分子构象变化，变化的酶分子又使底物分子的敏感键产生“张力”甚至“形变”，产生“电子张力”而引起敏感键的一端更加敏感，使底物比较接近它的过渡态，形成一个相互契合的酶-底复合物，进一步转换成过渡态，降低反应活化能，大大提高酶促反应速度。3、酸碱催化酸-碱催化可分为狭义的酸-碱催化和广义的酸-碱催化。酶参与的酸-碱催化反应一般都是广义的酸－碱催化方式。广义酸－碱催化是指通过质子酸提供部分质子,或是通过质子碱接受部分质子的作用，达到降低反应活化能的过程。

广义酸基团（质子供体）广义碱基团（质子受体）

酶活性中心上有的基团是质子供体，有的为质子受体，均可进行催化作用。酶蛋白中起广义酸碱催化作用的功能基：氨基、羰基、羧基、硫氢基、酚羟基和咪唑基。组氨酸的咪唑基：既是很强的亲核基团，又是有效的广义酸碱功能基。1）其解离常数约6.0，即其解离下来的质子浓度与水中的[H+]相近，所以在中性条件下，有一半以酸形式存在，另一半以碱形式存在，即可作为质子供体，又可作质子受体而在酶反应中起催化作用；2）其供出和接受质子的速度十分迅速，且供出和接受的速度相等。

4、共价催化催化剂通过与底物形成反应活性很高的共价过渡产物，使反应活化能降低，从而提高反应速度的过程，称为共价催化；酶的亲核基团（如羟基、巯基）对底物的亲电子中心进行攻击。亲核基团含有可提供电子的原子，向底物亲电子的原子提供电子，由此形成不稳定的共价中间物。但酶的亲核基团易变，所形成的共价中间物不稳定，随后会被水分子或第二种底物攻击而给出所需的产物，由此可加快中间物的分解而释放出产物。酶蛋白分子上的主要亲核基团：Ser的的羟基、Cys的硫基、His的咪唑基、Asp的羧基。某些辅酶，如焦磷酸硫胺素和磷酸吡哆醛等也可以参与共价催化作用。5、金属离子催化（1）金属离子催化：大部分酶的催化活性需要金属离子的参与。（2）分类金属酶:金属离子作为酶的辅基金属激活酶：金属离子作为酶的激活剂（3）机理通过结合底物为反应定向；通过可逆地改变金属离子的氧化态调节氧化还原反应；通过静电稳定或屏蔽负电荷。6、活性部位微环境的影响某些酶的活性中心穴内相对是非极性的，催化基团被低介电环境包围，并排除高极性的水分子。这样，底物分子的敏感键和酶的催化基团之间就会有很大的反应力。水会减弱极性基团间的相互作用。水的极性和形成氢键的能力很大，水的介电常数极高。这种高极性使它在离子外形成定向的溶剂层，产生自身的电场，从而大大减少了它所所包围的离子间的静电作用或氢键作用。三、酶催化反应机制的实例1、溶菌酶溶菌酶的生物学功能是催化细菌细胞壁多糖的水解。（1）细胞壁多糖：N-乙酰氨基葡萄糖（NAG）-N-乙酰氨基葡萄糖乳酸（NAM）的共聚物，NAG与NAM以β-1,4糖苷键交替排列。

溶菌酶N-乙酰胞璧酸:N-乙酰葡糖胺与乳酸形成的醚类（2）溶菌酶的最适小分子底物：为NAG-NAM交替的六糖，以A、B、C、D、E、F表示，其中D是NAM。（3）溶菌酶分子中有一个狭长的凹穴，正适合于小分子底物的嵌合。凹穴中的Glu35和Asp52是活性中心的氨基酸残基。（4）作用原理当酶与细胞壁接触时，与六个暴露在外的氨基糖残基结合。此时酶的构象发生变化，Glu35和Asp52相互靠近，并与底物的D糖起“靠近”和“定向”效应：Asp52羧基上的一个氧原子距离D环上的C1及D环上的氧原子只有0.3nm，Glu35羧基上的一个氧原子距离D糖的糖苷键上的氧原子也只有0.3nm；同时，在酶作用下，D糖构象也发生变形，由正常椅式变成能量较高的半椅式或船式构象。结合后，Glu35由于处于非极性区，呈不解离状态-COOH，这样它可以起着广义酸催化作用，提供一个质子给糖苷键的氧原子，使得氧原子与D环C1间的糖苷键断开，而C1带上正电荷，成为正碳原子C1+。处于极性区的Asp52在通常情况下呈离子化状态-COO-，这样它就起着稳定C1+的作用，协调C1-O间糖苷键的断裂，直到环境中水分子的OH-与C1+结合，H+与Glu35结合，使两者恢复非离子化形式。由此完成一次水解反应。2、胰凝乳蛋白酶(1)专一性地水解芳香族氨基酸和大的疏水氨基酸的羧基形成的肽键。（2）胰凝乳蛋白酶的活性中心

由Ser195、His57和Asp102组成，其中Ser195是酶活性中心的底物结合部位，His57是活性中心内的催化部位，在三维结构中这三个氨基酸残基是十分靠近的。（3）胰凝乳蛋白酶作用原理

活性中心的Ser195、His57及Asp102构成一个氢键体系，使His57的咪唑基成为Asp102羧基及Ser195羟基间的桥梁，Ser195由于His57及Asp102的影响而成为很强的亲核基团，易于提供电子。这个氢键体系称为“电荷中继网”。在大部分情况下，网中Asp102以离子化形式-COO-，Ser195以非离子化形式-CH2OH存在；但也有另一种情况，即由于Asp102从Ser195吸引一个质子所造成，想接力赛跑那样，质子先从Ser195传递到His57上，再由His57传递到Asp102上。在此酶促反应中，His57咪唑基起着广义酸碱催化作用：先促进Ser195的羟基亲核地附着到底物敏感肽键的羰基碳原子上，形成共价的酰化中间物，再促进酰化的ES中间物上的酰基转移到水或其他的酰基受体（如醇，氨基酸等）上。其对多肽底物水解可分两个阶段：

A、水解反应的酰化阶段Ser195羟基的氧原子对底物敏感键的羰基碳原子进行亲核攻击，形成了一个为时暂短的四联体过渡态。在这过渡态中，底物的酰基部分与Ser195的羟基、氨基部分与His57的咪唑基相连接。在此过程中，通过电荷中继网（丝氨酸向组氨酸提供质子）发生反应，敏感肽键断裂，底物中的胺成分通过氢键与His57咪唑基相连，底物的羧基部分通过酯键与Ser195的羟基相连。

B、水解反应的脱酰阶段

首先胺从酶上释放出来，底物的羧基部分与酶就成了酰化酶，这是中间复合物。接着水分子进入活性中心，电荷中继网从水中吸收一个质子，结果OH-立即攻击已连在Ser195上的底物羧基碳原子，也形成一个短暂的四联体过渡态。然后His57供出一个质子到Ser195的氧原子上，结果底物中的酸成分从Ser195上释放出来，酶又恢复自由状态。3、糜蛋白酶4、羧肽酶（1）此酶是单链蛋白质，其中紧密地结合着一个Zn2+离子。这个离子对酶的活性很重要。该酶是一个外肽酶，催化肽链C-末端的肽键水解。在酶的三维结构中，Zn2+离子处于接近酶表面的沟槽中，它与两个组氨酸（His196,69）侧链和一个谷氨酸（Glu72）及一个水分子形成一个四面体，Zn2+离子在此四面体中与这三个氨基酸以配价键相连。离Zn2+离子不远有一个“裂缝”（见下图），允许底物C-末端伸入。裂缝顶部还有一个口袋，可以接受C-末端的R基团，酶的Tyr248（酪）、Arg145（精）、Glu270及Zn2+将底物分子适当地定位于活性中心中。（2）作用原理A、在底物诱导下，酶活性中心的结构发生巨大改变，底物的“靠近”和“定向”效应十分显著；B、酶的Glu270使底物的敏感肽键发生电子张力，使敏感肽键变得极易断裂。C、底物结合的过程分五步酶侧链中Arg145上的正电荷与底物C-末端氨基酸残基上羧基的负电荷发生静电吸引作用；该氨基酸残基进入酶的非极性口袋中；底物敏感键上羰基中的氧与Zn2+离子相接近；底物的末端氨基通过一个插入的水分子与酶中Glu270的侧链建立氢键。

D、构象变化结果Arg145的胍基和Glu270的羧基相向移动了0.2nm；Arg145的结合，使底物末端从口袋中推走了4个水分子，并将结合在Zn2+离子上的水分子推开（但留在附近），底物自身结合到Zn2+离子上；由于Arg145的移动带动了Tyr248的羟基移动1.2nm，从酶表面移到底物肽键附近，由此关闭了活性中心的凹道，活性中心从充满水的状态转变为疏水区。

E、酶与底物结合后，Zn2+离子、Glu270和Tyr248的作用：

Zn2+离子：使敏感肽键产生电子张力。酶与底物靠近时，敏感肽键指向Zn2+离子，在该离子作用下，底物羰基碳原子的电子云密度降低，呈正电性，这样羰基碳原子在亲核攻击下更加脆弱。同时Glu270负电荷靠近肽键加大了这种偶极矩。因此Zn2+离子对底物造成的电子张力大大地促进了底物的水解。

Glu270和Tyr248：第一种说法：Glu270首先激活水分子，使其释放出OH-，由OH-直接攻击底物敏感肽键的羰基碳原子，同时Tyr248提供一个质子，由此底物的肽键直接水解；第二种说法：Glu270直接攻击羰基碳原子，并且Tyr248向该肽键的-NH-提供一个质子，肽键断开，生成一个胺和一个Glu270与底物羰基相连的酸酐，最后水分子使酸酐水解，生成一个酸和复原的酶。注意：（1）Tyr248参与底物与酶的结合过程，而在催化过程中仅仅是起提供质子的作用，并不是催化所必需的；（2）在羧肽酶A中，底物有末端羧基，就能与Arg145的正离子基团形成盐键，触发Tyr248移至酶活性中心。如果底物没有末端羧基，就不发生这种结合和移动，酶则不表现活性。

结论胰凝乳蛋白酶其活性中心由Ser195、His57及Asp102构成一个电荷转接系统，称为电荷中继网，其催化反应包括水解反应的酰化阶段和水解反应的酰化阶段。胰蛋白酶、弹性蛋白酶都来源于胰脏，与胰凝乳蛋白酶的三维结构极为相似，一级结构氨基酸序列也有40%的相似性，三者活性中心的丝氨酸残基附件的氨基酸序列完全一样，同属丝氨酸蛋白酶家族；他们的作用机理表现出极大的相似性，但底物的专一性有很大的差异。四、酶的调节1、别构调节当效应物分子可逆地结合到酶的某一非催化部位时，引起酶的结构（构象）变化，进而改变酶的活性，这种调节称别构调节。受别构调节的酶称别构酶，引起别构调节的效应物称调节物别构激活：因别构而导致酶活性增加别构抑制：因别构而导致酶活性降低不同（效应调节物）：异促效应（heterotropiceffect）相同（均为底物）：同促效应（homotropiceffect）调节物结合后对后继配体的影响调节物性质正协同效应（positivecooperativeeffect）负协同效应（negativecooperativeeffect）（1）别构酶(Allostericenzyme)的结构特征

别构酶一般是寡聚酶，常含多个亚基（有四级结构），通过次级键由多亚基构成。除有结合底物和起催化作用的活性中心外，还含可结合调节物的别构中心，前者负责对底物的结合和催化，后者负责调节反应速度。别构酶的活性中心（活性部位）和别构中心（调节部位）位于酶蛋白的不同部位上，可能在同一亚基上，也可能分别在不同的亚基上；每个别构酶分子可以有一个以上的活性部位和调节部位。（2）别构酶的动力学别构酶不符合米氏方程，存在协同效应。所以其[S]对v的动力学曲线不是双曲线，而是S形曲线（正协同）或表观双曲线（负协同）。

S形曲线：表明酶结合一分子底物（或调节物）后，酶的构象发生变化，从而大大增加对后续底物分子的亲和性，促进后续分子与酶的结合，表现为正协同性，这种酶称为具正协同效应的别构酶。表观双曲线：在底物浓度较低范围内酶的活力上升很快，但随后底物浓度虽有较大的提高，但反应速度升高却很小，表现为负协同性，这种酶称为具有负协同效应的别构酶。怎么区分米氏酶与别构酶？koshland建议用饱和比值（saturationratio,Rs）典型的米氏酶RS=81具有正协同效应的别构酶RS<81具有负协同效应的别构酶RS>81

米氏酶的Km和别构酶的K0.5都是指反应速率为Vmax一半时的底物的浓度K型效应物和V型效应物：能改变底物的K0.5而不改变反应Vmax的效应物称为K型效应物；能改变Vmax而不改变K0.5的效应物称为V型效应物。别构酶的脱敏作用：别构酶经加热或化学试剂处理，可引起别构酶解离，失去调节活性，称为脱敏作用。脱敏后的酶表现为米氏酶的动力学双曲线。（3）别构酶范例(天冬氨酸转氨甲酰酶,ATCase)

底物N-氨甲酰磷酸和天冬氨酸促进ATCase活性，为同促效应；CTP为最终产物，降低了酶与底物的亲和性，抑制ATCase活性；ATP为非底物分子，但可增强酶与底物的亲和性而激活ATCase，起到