第七章 液相色谱课件

八、液相色谱法1

第七章液相色谱

§7-1概述（1）液相色谱简介（2）液相色谱的发展（3）液相色谱的分类§7-2液相色谱仪（1）液相色谱仪（2）液相色谱仪的流程图（3）液相色谱仪的工作过程（4）液相色谱仪的基本组成系统（5）高压泵八、液相色谱法2第七章液相色谱(liquidchromatography)（6）梯度洗脱装置（7）进样器（8）色谱柱（9）色谱填料（10）检测器（11）数据处理系统与自动控制单元§7-3新型液相色谱仪简介（1）waters的UPLC（2）岛津高效率HPLC-2010A/2010C型（3）岛津LC-VP系列应用系统离子色谱仪§7-4液相色谱的应用八、液相色谱法3第七章液相色谱(liquidchromatography)

八、液相色谱法4第七章

液相色谱

(liquidchromatography)

§7-1概述八、液相色谱法5第七章

液相色谱(liquidchromatography)

§7-1概述

（1）液相色谱简介液相色谱是以液体为流动相的色谱分析方法。英文缩写：LC。按其固定相的不同，又可分为液固色谱（LSC）和液液色谱（LLC）八、液相色谱法6第七章

液相色谱(liquidchromatography)

§7-1概述

（2）液相色谱的发展在所有色谱技术中，液相色谱法是最早（1903年）发明的，但其初期发展较慢，在液相色谱普及之前，纸色谱法、气相色谱法和薄层色谱法是色谱分析法的主流。到了20世纪60年代后期，将已经发展得比较成熟的气相色谱的理论与技术应用到液相色谱上来，使液相色谱得到了迅速的发展。特别是填料制备技术、检测技术和高压输液泵性能的不断改进，使液相色谱分析实现了高效化和高速化。具有这些优良性能的液相色谱仪于1969年商品化。从此，这种分离效率高、分析速度快的液相色谱就被称为高效液相色谱法（highperformanceliquidchromatography，HPLC），也称高压液相色谱法或高速液相色谱法。

八、液相色谱法7A：

高效液相色谱与经典液相色谱方法的比较高速：HPLC采用高压输液设备，流速大增加，分析速度极快，只需数分钟；而经典方法靠重力加料，完成一次分析需时数小时。高效：填充物颗粒极细且规则，固定相涂渍均匀、传质阻力小，因而柱效很高。可以在数分钟内完成数百种物质的分离。高灵敏度：检测器灵敏度极高：UV——10-9g,荧光检测器——10-11g。B：.HPLC与GC的比较分析对象及范围：GC分析只限于气体和低沸点的稳定化合物，而这些物质只点有机物总数的20%；HPLC可以分析高沸点、高分子量的稳定或不稳定化合物，这类物质占有机物总数的80%。流动相的选择：GC采用的流动相中为有限的几种“惰性”气体，只起运载作用，对组分作用小；HPLC采用的流动相为液体或各种液体的混合，可供选择的机会多。它除了起运载作用外，还可与组分作用，并与固定相对组分的作用产生竞争，即流动相对分离的贡献很大，可通过溶剂来控制和改进分离。操作温度：GC需高温；HPLC通常在室温下进行。八、液相色谱法8第七章

液相色谱(liquidchromatography)

§7-1概述

（3）液相色谱的分类广义地讲，固定相为平面状的纸色谱法和薄层色谱法也是以液体为流动相，也应归于液相色谱法。不过通常所说的液相色谱法仅指所用固定相为柱型的柱液相色谱法。

通常将液相色谱法按分离机理分成吸附色谱法、分配色谱法、离子色谱法和凝胶色谱法四大类。但有些液相色谱方法并不能简单地归于这四类。

第七章

液相色谱(liquidchromatography)

§7-1概述

（3）液相色谱的分类类型主要分离机理主要分析对象或应用领域吸附色谱吸附能，氢键异构体分离、族分离，制备分配色谱疏水分配作用各种有机化合物的分离、分析与制备凝胶色谱溶质分子大小高分子分离，分子量及其分布的测定离子交换色谱库仑力无机离子、有机离子分析离子排斥色谱Donnan膜平衡有机酸、氨基酸、醇、醛分析离子对色谱疏水分配作用离子性物质分析疏水作用色谱疏水分配作用蛋白质分离与纯化手性色谱立体效应手性异构体分离，药物纯化亲和色谱生化特异亲和力蛋白、酶、抗体分离，生物和医药分析表7－1液相色谱分类八、液相色谱法10两种最常用的色谱法（一）吸附色谱法（adsorptionchromatography）

以吸附剂为固定相的色谱方法称为吸附色谱法。使用最多的吸附色谱固定相是硅胶，流动相一般使用一种或多种有机溶剂的混合溶剂。在吸附色谱中，不同的组分因和固定相吸附力的不同而被分离。组分的极性越大、固定相的吸附力越强，则保留时间越长。流动相的极性越大，洗脱力越强，则组分的保留时间越短。

八、液相色谱法11

液-液分配色谱的固定相和流动相是互不相溶的两种溶剂，分离时，组分溶入两相，不同的组分因分配系数（K)的不同而被分离。目前广泛使用的化学键合固定相是将固定液的官能团键合在载体上而制成的，使用化学键合固定相的色谱方法（简称键合相色谱法）可以用分配色谱的原理加以解释。键合相色谱法在HPLC中占有极其重要的地位，是应用最广的色谱法。

按照固定相和流动相极性的不同，分配色谱法又可分为正相色谱法和反相色谱法两类。（二）液-液分配色谱法（liquid-liquidchromatography)

八、液相色谱法121.正相色谱法（normalphasechromatography)

固定相极性大于流动相极性的分配色谱法称为正相分配色谱法，简称为正相色谱法。氰基键合硅胶、氨基键合硅胶等极性的化学键合固定相是正相色谱常用的固定相，正相色谱的流动相一般为极性较小的有机溶剂。在正相色谱中，极性小的组分由于K值较小先流出，极性较大的组分后流出。正相色谱法用于溶于有机溶剂的极性及中等极性的分子型物质的分离。

八、液相色谱法13

流动相极性大于固定相极性的分配色谱法称为反相分配色谱法，简称为反相色谱法。反相色谱法使用非极性固定相，最常用的非极性固定相是十八烷基硅烷键合硅胶，还有辛烷基硅烷键合硅胶等。流动相常用水与甲醇、乙腈或四氢呋喃的混合溶剂。在反相色谱中极大的组分因K值较小先流出色谱柱，极性较小的组分后流出。流动相中有机溶剂的比例增加，流动相极性减小，洗脱力增强。反相色谱法是目前应用最广的高效液相色谱法。

2.反相色谱法（reversedphasechromatography）八、液相色谱法14第七章

液相色谱

(liquidchromatography)§7-2液相色谱仪返回八、液相色谱法15第七章液相色谱(liquidchromatography)

§7-2液相色谱仪

（1）液相色谱仪现在的液相色谱仪一般都做成一个个单元组件，然后根据分析要求将各个所需单元组件组合起来。最基本的组件是高压输液泵、进样器、色谱柱、检测器和数据系统（记录仪、积分仪或色谱工作站）。此外，还可根据需要配置流动相在线脱气装置、梯度洗脱装置、自动进样系统、柱后反应系统和全自动控制系统等。八、液相色谱法16第七章液相色谱(liquidchromatography)

§7-2液相色谱仪

（2）液相色谱仪的流程图图7－1液相色谱仪的流程图八、液相色谱法17第七章液相色谱(liquidchromatography)

§7-2液相色谱仪

（3）液相色谱仪的工作过程输液泵将流动相以稳定的流速（或压力）输送至分析体系，在色谱柱之前通过进样器将样品导入,流动相将样品带入色谱柱,在色谱柱中各组分因在固定相中的分配系数或吸附力大小的不同而被分离，并依次随流动相流至检测器，检测到的信号送至数据系统记录、处理或保存。八、液相色谱法18第七章液相色谱(liquidchromatography)

§7-2液相色谱仪

（4）液相色谱仪的基本组成系统1.流动相的流路系统（高压输液系统：储液器、混合室、高压泵、过滤器、压力脉动阻力器、梯度洗脱装置等组成。核心：高压输液泵）2.进样系统：进样器（微量注射器或六通阀）3.分离系统：色谱柱4.检测系统：示差折光、紫外-可见、荧光、极谱、红外等。5.信号放大记录系统八、液相色谱法19第七章液相色谱(liquidchromatography)

§7-2液相色谱仪

（5）高压泵

高压输液泵是液相色谱仪的关键部件，其作用是将流动相以稳定的流速或压力输送到色谱系统。对于带在线脱气装置的色谱仪，流动相先经过脱气装置再输送到色谱柱。输液泵的稳定性直接关系到分析结果的重复性和准确性。通常要求高压泵具有：流量可调、耐高压、液流稳定、死体积小等特点。输液泵按输出液恒定的因素分恒压泵和恒流泵。对液相色谱分析来说，输液泵的流量稳定性更为重要，这是因为流速的变化会引起溶质的保留值的变化，而保留值是色谱定性的主要依据之一。因此，恒流泵的应用更广泛。八、液相色谱法20第七章液相色谱(liquidchromatography)

§7-2液相色谱仪

（6）梯度洗脱装置在进行多成分的复杂样品的分离时，经常会碰到前面的一些成分分离不完全，而后面的一些成分分离度太大，且出峰很晚和峰型较差。为了使保留值相差很大的多种成分在合理的时间内全部洗脱并达到相互分离，往往要用到梯度洗脱技术。在液相色谱中流速（压力）梯度和温度梯度效果不大，而且还会带来一些不利影响，因此，液相色谱中通常所说的梯度洗脱是指流动相梯度，即在分离过程中改变流动相的组成或浓度。八、液相色谱法21第七章液相色谱(liquidchromatography)

§7-2液相色谱仪

（7）进样器进样器是将样品溶液准确送入色谱柱的装置，分手动和自动两种方式。进样器要求密封性好，死体积小，重复性好，进样时引起色谱系统的压力和流量波动要很小。除使用自动进样装置外，现在的液相色谱仪所采用的手动进样器几乎都是耐高压、重复性好和操作方便的六通阀进样器，实现了常压下不停流进样。八、液相色谱法22

六通进样阀可分为定子和转子两部分，共有6个口，故称为六通进样阀。转子通过扳手调节，可以分别处于“装样”和“进样”两个位置。图中a为进样阀处于“装样”位置的情况，此时流动相直接进入色谱柱，样品注入口与样品环连接，用微量进样针将一定体积的样品溶液从样品注入口注入，装于样品管内。当将扳手扳至“进样”位时，进样阀的流路发生了改变，流动相通过样品管，将注入的样品带入色谱柱进行分析。六通进样阀具有使用方便，进样量准确等优点。样品环有10µl、20µl、50µl等不同容积，可以选配。样品环不仅可以用来贮液，也可用来测量样品溶液的体积。将样品环装满后，进样，进样量即为样品环的容积，此种进样方式称为“满环进样”或“定量环进样”。用定量环进样精密度好，在使用外标法时，应使用此种操作方式。

八、液相色谱法23六通进样阀结构如图所示：八、液相色谱法24第七章液相色谱(liquidchromatography)

§7-2液相色谱仪

（8）色谱柱色谱柱是实现分离的核心部件，要求柱效高、柱容量大和性能稳定。柱性能与柱结构、填料特性、填充质量和使用条件有关。色谱柱：是将色谱填料填充到色谱柱管中所构成的。色谱柱管：内部抛光的不锈钢管。色谱往长一般10～30cm，内径2～5mm。典型的液相色谱分析柱尺寸是内径4.6mm，长250mm。色谱柱的填充干法填充：在硬台面上铺上软垫，将空柱管上端打开垂直放在软垫上，用漏斗每次灌入50～100mg填料，然后在台面上墩10～20次。湿法填充：使用专门的填充装置进行填充。八、液相色谱法25第七章液相色谱(liquidchromatography)

§7-2液相色谱仪

（9）色谱填料色谱填料：经过制备处理后，用于填充色谱柱的物质颗粒，通常是5-10粒径的球形颗粒。色谱填料基质：又常称作载体或担体，通常制备成数微米至数十微米粒径的球形颗粒，它具有一定的刚性，能承受一定的压力，对分离不起明显的作用，只是作为功能基团的载体。常用来作基质的有硅胶和有机高分子聚合物微球功能层：是通过化学或物理的方法固定在基质表面的、对样品分子的保留起实质作用的有机分子或功能团。

化学键合相是广泛使用的固定相，其中又以十八烷基硅烷键合硅胶（octadecylsilylsilicagel，ODS）的应用最为广泛，ODS为非极性化学健合相，此外还有辛烷基硅烷键合硅胶等，非极性化学健合相用于反相色谱法八、液相色谱法26第七章液相色谱(liquidchromatography)

§7-2液相色谱仪

（10）监测器检测器：

用来连续监测经色谱柱分离后的流出物的组成和含量变化的装置。检测器利用溶质的某一物理或化学性质与流动相有差异的原理，当溶质从色谱柱流出时，会导致流动相背景值发生变化，从而在色谱图上以色谱峰的形式记录下来。

表§7-2常用的液相色谱监测器检测器检测下限/(g/ml)线性范围主要特点紫外-可见光10－10103～

104对流速和温度变化敏感；池体积可制作得很小；对溶质的响应变化大。示差折光10－1104可检测所有物质；不适合微量分析；对温度变化敏感荧光10－12～

10－11103选择性和灵敏度高；易受背景荧光、消光、温度、pH和溶剂的影响。化学发光10－13～

10－12103灵敏度高；发光试剂受限制；易受流动相组成和脉动的影响。电导10－2103～

104是离子性物质的通用检测器；受温度和流速影响；不能用于有机溶剂体系。质谱10－10主要用于定性和半定量。原子吸收光谱10－13～

10－10选择性高。等离子体发射光谱10－2～

10－10可进行多元素同时检测。八、液相色谱法28常用检测器：紫外检测器

应用最广，对大部分有机化合物有响应。

(1)普通紫外检测器

紫外检测器是高效液相色谱中应用最广的一种检测器。用一定波长的单色光照射流通池，流动相携带被分离的组分进入流通池时，流动相在测定波长处不吸收光或吸收很弱，测

定组分在该波长处有很强的吸收，记录不同时间对光的吸收度，就得到一张色谱图。组分光的吸收符合Iambert-beer定律，因此色谱峰的面积和组分的量成正比关系。紫外检测器的特点是灵敏度高，线性范围宽，对温度和流动相的波动不敏感，可用于梯度洗脱。但紫外检测器只能检测具有紫外吸收的组分，像糖类、脂肪酸类等在测定范围内无紫外吸收的组分不能检侧。用普通紫外检侧器也不便测定流出组分的紫外吸收光谱，有的紫外检测器虽可测

定紫外吸收光谱，但在组分到达检测器时需停流，再扫描。

八、液相色谱法29八、液相色谱法30(2)光二极管阵列检浏器(photodiodearraydetector，PDAD）

光二极管阵列检测器是20世纪80年代出现的一种光学多通道检测器，它可以在瞬间完成对组分的紫外扫描。1024个二极管阵列，各检测组分特定波长，在190～800nm范围内扫描，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。

八、液相色谱法31光电二极管阵列检测器图谱三维光谱-色谱图

八、液相色谱法32八、液相色谱法33第七章液相色谱(liquidchromatography)

§7-2液相色谱仪

（11）数据处理系统与自动控制单元数据处理系统：

又称色谱工作站。它可对分析全过程（分析条件、仪器状态、分析状态）进行在线显示，自动采集、处理和储存分析数据。自动控制单元：将各部件与控制单元连接起来，在计算机上通过色谱软件将指令传给控制单元，对整个分析实现自动控制，从而使整个分析过程全自动化。也有的色谱仪没有设计专门的控制单元，而是每个单元分别通过控制部件与计算机相连，通过计算机分别控制仪器的各部分。图7－2岛津色谱仪用工作站返回八、液相色谱法34第七章

液相色谱

(liquidchromatography)§7-3新型液相色谱仪简介返回八、液相色谱法35第七章液相色谱(liquidchromatography)

§7-3新型液相色谱仪简介

（1）waters的UPLC超高效液相色谱是分离科学中的一个全新类别，它给实验室带来了新奇而强大的能力。UPLC™借助于HPLC的理论及原理，涵盖了小颗粒填料、非常低系统体积及快速检测手段等全新技术，增加了分析的通量、灵敏度及色谱峰容量。ACQUITYUltraPerformanceLC™

系统的整体设计可以控制并优化所有的参数，以充分实现今天实验室中UPLC技术所能带来的任何利益。图7－3waters的UPLC八、液相色谱法36第七章液相色谱(liquidchromatography)

§7-3新型液相色谱仪简介

（2）岛津高效率HPLC-2010A/2010C型通过高速进样及多样品处理大幅提高了分析效率的一体型HPLC。如果使用自动启动、停机功能、自动有效性功能，则可实现分析、管理自动化，进一步提高了生产效率。另外，图解式画面和魔块功能使操作更为便利。图7－4岛津高效率HPLC-2010A/2010C型八、液相色谱法37第七章液相色谱(liquidchromatography)

§7-3新型液相色谱仪简介

（3）岛津LC-VP系列应用系统离子色谱仪与先进的自动抑制器组合，进一步发挥出离子色谱仪的性能，可进行超高灵敏度的离子分析。另外，还可构成高稳定性，操作简便的非抑制型离子色谱仪。图7－5岛津LC-VP系列应用系统离子色谱仪返回八、液相色谱法38第七章

液相色谱

(liquidchromatography)

§7-4液相色谱的应用返回

几乎在所有学科领域都有广泛应用，可以用于绝大多数物质成分的分离分析，它和气相色谱都是应用最广泛的仪器分析技术。

应用领域分析对象举例环境常见无机阴阳离子、多环芳烃、多氯联苯、硝基化合物、有害重金属及其形态、除草剂、农药、酸沉降成分。农业土壤矿物成分、肥料、饲料添加剂、茶叶等农产品中无机和有机成分。化工无机化工产品、合成高分子化合物、表面活性剂、洗涤剂成分、化妆品、染料。食品无机阴阳离子、有机酸、氨基酸、糖、维生素、脂肪酸、香料、甜味剂、防腐剂、人工色素、病原微生物、霉菌毒素、多核芳烃。生物氨基酸、多肽、蛋白质、核糖核酸、生物胺、多糖、酶、天然高分子化合物。医药人体化学成分、各类合成药物成分、各种天然植物和动物药物化学成分。第七章液相色谱(liquidchromatography)

§7-4液相色谱的应用表7-3液相色谱的应用返回八、液相色谱法40举例：HPLC在药物分析中的应用

高效液相色谱法分离效能高，应用范围广，灵敏度高，仪器已较成熟、普及，在新药的研究开发，药品检验，生物样品的分析中应用十分广泛。

（一）色谱系统适用性试验

由于色谱分离的效果受色谱柱的状况，流动相组成等因素的影响很大，为保证测定结果的准确，中国药典规定，在进行色谱分析前需检查色谱系统是否正常，是否符合要求，即需要作色谱系统适用性试验，色谱系统适用性试验的内容有：

八、液相色谱法411.色谱柱的理论板数

在规定的色谱条件下，注入供试品溶液或各品种项下规定的内标物质溶液记录色谱图，量出测定组分或内标物质峰的保留时间tR和半高峰宽Wh/2，按下式计算色谱往的理论板数：

n=5.54(tR/Wh/2)2

如果测得理论板数低于各品种项下的规定，应更换色谱柱或其他条件使理论板数达到要求。

色谱柱的理论板数主要取决于半高峰宽Wh/2，在一定的条件下，wh/2越窄，理论板数越高，相邻峰的分离越好2。分离度

分离度用来表示相邻两峰分离的程度。分离度（R）的计算公式为：

2(tR2―tR1)

R=

W1+W2

八、液相色谱法42除另外有规定外，分离度应大于1.5。当分离度大于1.5时，相邻两峰达到了完全分离。

3.重复性取各品种