DB11 T 379-2006 豆芽中4-氯苯氧乙酸钠 6-苄基腺嘌呤 2,4-滴 赤霉素 福美双的测定

ICS67.080.20备案号：19170-2006DB北京市地方标准DB11/T379—20062,4-滴、赤霉素、福美双的测定Determinationof4-chlorphenoxyaceticsodium,6-benzylaminopurine,2,4-D,gibberellicacidandthiramresiduesinsoybeansproutandmubeansprout2006-07-25发布2006-09-01实施北京市质量技术监督局发布IDB11/T379—2006 124-氯苯氧乙酸钠残留量的测定 136-苄基腺嘌呤残留量的测定 342,4-滴（2,4-二氯苯氧乙酸）残留量的测定 55赤霉素残留量的测定 76福美双残留量的测定 9DB11/T379—2006本标准由通州区质量技术监督局提出。本标准起草单位：北京市海淀区产品质量监督检验所（国家食品质量安全监督检验中心）。本标准主要起草人：曹红、金瑛、刘艳琴、许华、王浩、田艳玲、林立。1DB11/T379—20062,4-滴、赤霉素、福美双的测定本标准规定了豆芽中4-氯苯氧乙酸钠、6-苄基腺嘌呤、2,4-滴、赤霉素、福美双的测定方法。本标准适用于豆芽中4-氯苯氧乙酸钠、6-苄基腺嘌呤、2,4-滴、赤霉素、福美双的残留量分析。24-氯苯氧乙酸钠残留量的测定2.1原理试样中的4-氯苯氧乙酸钠用稀碱提取后，在酸性条件下用固相萃取柱将样品中的4-氯苯氧乙酸吸附，使其与基体干扰物分离，再用甲醇洗脱并用高效液相色谱法测定，以保留时间定性，外标法峰面2.2试剂与材料2.2.1氢氧化钠（AR）。2.2.2盐酸（AR）。2.2.3磷酸（AR）。2.2.4冰醋酸（AR）。2.2.5甲醇（HPLC）。2.2.6氢氧化钠溶液（0.01mol/L）：称取0.40g氢氧化钠，溶于水并稀释至1000mL。2.2.7亚铁氰化钾溶液：称取10.6g亚铁氰化钾[K4Fe(CN)6·3H2O]溶于少量水中，并用水稀释至2.2.8乙酸锌溶液：称取22.0g乙酸锌[Zn(CH3COO)2]溶于少量水中，然后加入3mL冰醋酸并加水稀释至100mL。2.2.9磷酸盐缓冲液（0.01mol/L）：称取1.56g的磷酸二氢钠（NaH2PO4·2H2O）加水溶解，并定容至1000mL，用50%的磷酸溶液调节pH值至4.0。2.2.104-氯苯氧乙酸标准溶液：精密称取4-氯苯氧乙酸（含量≥99%）0.1g(精确到0.0001g)，用甲醇溶解并移入100mL容量瓶中，稀释至刻度。此溶液每毫升相当于1.00mg4-氯苯氧乙酸。临用时甲醇稀释浓度为每毫升相当于0.10mg4-氯苯氧乙酸。2.2.11固相萃取小柱（3mL/500mgODS-C18小柱，用时先经10mL甲醇洗脱活化，再用10mL水洗去残留甲醇，保持萃取柱润湿状态待用。2.2.12本标准所用水为经纯水制备系统制备后的水。2.3仪器与设备2.3.1高效液相色谱仪（带紫外检测器，配ZORBAXSBC18色谱柱）。2.3.2超声波仪。2.3.3酸度计。2.3.4组织捣碎机。2.3.5Milli-Q纯水制备系统。2.4分析步骤2.4.1试样制备称取捣碎混匀的豆芽样品20g（精确至0.1g）于100mL容量瓶中，加入40ml氢氧化钠溶液振摇，然后分别加入亚铁氰化钾溶液和乙酸锌溶液各5mL，混匀，超声提取30min，用氢氧化钠溶液稀释至2DB11/T379—2006刻度，过滤。取50.0mL的滤液，用浓磷酸调pH至2.5，然后以3mL/min的流速通过活化的ODS-C18小柱。先用3.0mL水洗去水溶性杂质后，再用甲醇洗脱并定容至3.0mL，过0.45μm滤膜后，供液相色谱分析。2.4.2标准曲线的制备准确吸取每毫升相当于0.10mg的4-氯苯氧乙酸0.20mL、0.50mL、1.00mL、2.00mL、4.00mL4.00mg/L的标准使用液，供液相色谱分析。2.4.3色谱条件色谱柱：ZORBAXSBC18柱（4.6mm×250mm×5μm或相当型号色谱柱）。检测波长：228nm。流动相：甲醇+0.01mol/L磷酸盐缓冲液（50+50）(V/V)。流速：1.0mL/min。柱温：30℃。2.4.4测定吸取10.0μL标准使用液和试样液分别注入液相色谱仪，按照2.4.3项条件进行检测，以保留时间定性，标准曲线法定量。标样及试样图谱见图1及图2。2.5计算按式（1）计算。×1.12…………X—试样中4-氯苯氧乙酸钠的含量，单位为毫克每千克（mg/kgA—从标准曲线上求出的试样液中4-氯苯氧乙酸的质量，单位为微克(μgf—试样的稀释倍数；m—试样的取样量，单位为克（g1.12—4-氯苯氧乙酸转换为4-氯苯氧乙酸钠的系数。计算结果保留两位有效数字。2.6精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。2.7检测限在本试验条件下，豆芽中4-氯苯氧乙酸钠的定量检测限为0.10mg/kg。图14－氯苯氧乙酸标样色谱图3DB11/T379—2006图2豆芽样品中4－氯苯氧乙酸色谱图36-苄基腺嘌呤残留量的测定3.1原理豆芽中残留的6-苄基腺嘌呤经酸化甲醇提取后，高效液相色谱法测定，以保留时间定性，外标法峰面积定量。3.2试剂与材料3.2.1乙酸（AR)。3.2.3乙腈（HPLC）。3.2.4甲醇（HPLC）。3.2.5酸化甲醇溶液：每100mL甲醇+水（60+40）(V/V)中加入乙酸50μL，混匀。3.2.66-苄基腺嘌呤标准溶液：精密称取6-苄基腺嘌呤0.1g（精确到0.0001g含量≥99.0%）于100mL容量瓶，用甲醇溶解并定容至刻度。此溶液每毫升相当于1.00mg6-苄基腺嘌呤。临用时用甲醇稀释浓度为每毫升相当于0.010mg6-苄基腺嘌呤。3.2.7固相萃取小柱（3mL/500mg）：ODS-C18小柱，用时先经10mL甲醇洗脱活化，再用10mL水洗去残留甲醇，保持萃取柱润湿状态待用。3.2.8本标准所用水为经纯水制备系统制备后的水。3.3仪器与设备3.3.1高效液相色谱仪（带紫外检测器，配ZORBAXSBC18色谱柱）。3.3.2Ultra-Turrax搅拌器。3.3.3离心机（4500r/min）。3.3.4旋转蒸发仪。3.3.5组织捣碎机。3.3.6Milli-Q纯水制备系统。3.4分析步骤3.4.1试样制备称取捣碎混匀的豆芽样品10g（精确至0.1g）于50mL聚丙烯离心管中，加入15mL酸化甲醇溶液，用Ultra-Turrax搅拌器混匀3min,然后以4500r/min离心10min，上清液转入100mL梨形瓶中，样品再用15mL酸化甲醇溶液提取，再次离心，合并上清液。上清液用旋转蒸发仪蒸发，以去除甲醇，剩余水相以3mL/min的流速通过活化的ODS-C18小柱，先用3.0mL水洗去水溶性杂质后，再用甲醇洗脱并定容至5.0mL，过0.2μm有机膜滤过后，供液相色谱分析。3.4.2标准溶液系列的配制准确吸取每毫升相当于0.010mg的6-苄基腺嘌呤0mL、0.20mL、0.40mL、0.80mL、1.0mL、4DB11/T379—20062.0mL、5.0mL于25mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度。配制成浓度依次为0mg/L、0.08mg/L、0.16mg/L、0.32mg/L、0.40mg/L、0.80mg/L、2.00mg/L的标准溶液系列，供液相色谱分析。3.4.3色谱条件色谱柱：ZORBAXSBC18柱（4.6mm×250mm×5μm或相当型号色谱柱）。检测波长：267nm。流动相：甲醇+乙腈+1%乙酸溶液（60+5+35）(V/V)。流速：1.0mL/min。柱温：30℃。3.4.4测定准确吸取10.0μL标准系列溶液和试样溶液分别注入液相色谱仪中，按照3.4.3条件进行检测，以保留时间定性，峰面积外标法定量。标样及试样图谱见图3及图4。3.5计算按式（2）计算。……………………X—试样中6-苄基腺嘌呤的含量，单位为毫克每千克（mg/kgA—从标准曲线上求出的试样溶液中6-苄基腺嘌呤的质量，单位为微克(μgf—试样的稀释倍数；m—试样的取样量，单位为克（g计算结果保留两位有效数字。3.6精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。3.7检测限在本试验条件下，豆芽中6-苄基腺嘌呤的定量检测限为0.02mg/kg。606-benzylaminopurine504030200图36－苄基腺嘌呤标样色谱图5DB11/T379—20060mAU080608060402006-benzyl6-benzylaminopurine1234图4豆芽样品中6－苄基腺嘌呤色谱图42,4-滴（2,4-二氯苯氧乙酸）残留量的测定4.1原理试样中2,4-滴用有机溶剂提取，用三氟化硼甲醇溶液将2,4-滴衍生成2,4-滴甲酯，液-液萃取，凝胶渗透色谱净化除去干扰物质，以气相色谱电子捕获检测器测定。根据色谱峰保留时间定性，外标法峰面积定量。4.2试剂与材料4.2.1乙腈（AR）。4.2.2甲醇（AR）。4.2.3正己烷（AR）。4.2.4环己烷（AR）。4.2.5乙酸乙酯（AR）。4.2.6pH2的酸性水溶液：用50％稀硫酸调节水的pH为2。4.2.7氯化钠（AR）。4.2.850g/L氯化钠溶液。4.2.9无水硫酸钠：650℃灼烧4h后,保存于干燥器中。4.2.10三氟化硼乙醚溶液：47％(V/V)。4.2.11衍生剂(14％三氟化硼甲醇溶液)：量取29.5mL三氟化硼乙醚溶液，用甲醇定容至100mL。4.2.122,4-滴标准使用液：精密吸取1mL2,4-滴的甲醇标准溶液（浓度100μg/L），用甲醇溶解并定容至100mL。此溶液浓度为每毫升相当于1.00μg2,4-滴。4.2.13本标准所用水除另有规定外，均为蒸馏水。4.3仪器与设备4.3.1气相色谱仪：配有电子捕获检测器。4.3.2凝胶渗透色谱净化系统。4.3.3组织捣碎机。4.3.4恒温水浴锅。4.3.5旋转蒸发器。4.3.6电动振荡器。4.3.7顶空分析用20mL玻璃瓶，配套的铝盖和密封垫（或密封紧密的密封瓶）。4.4分析步骤4.4.1提取称取捣碎混匀的豆芽样品50.0g（精确到0.1g）于具塞锥形瓶内，加入20mL酸性水溶液和506DB11/T379—2006mL乙腈，振荡提取30min，过滤，滤渣用20mL乙腈洗涤两次,合并滤液于250mL分液漏斗中，于上述分液漏斗中加入15g氯化钠，振荡混匀，静置40min，分层，提取乙腈层，用旋转蒸发器除去乙腈，用5mL甲醇分次转移至20mL顶空分析玻璃瓶中。4.4.2衍生化加5mL衍生剂于上述顶空分析玻璃瓶中，将玻璃瓶加盖密封，在65℃水浴中保持45min后，取出玻璃瓶迅速置于冰浴中冷却，将衍生反应液转移至盛有10mL50g/L氯化钠溶液的50mL具塞比色管中，用正己烷提取二次，每次5mL，合并有机相，经无水硫酸钠脱水，旋转蒸发器挥至近干，用乙酸乙酯:环己烷（1:1，V/V）定容至10mL。4.4.32,4-滴甲酯标准工作液的制备取5mL2,4-滴标准使用液，依4.4.2方法制备2,4-滴甲酯标准工作液，经无水硫酸钠脱水，旋转蒸发器挥至近干后，用正己烷准确定容至5mL。此溶液浓度为每毫升相当于1.00μg2,4-滴。4.4.4凝胶渗透色谱净化选择凝胶渗透色谱柱规格（200mm×22mmi.d.柱填料为BioBeadsS-X3200-400目，流动相乙酸乙酯:环己烷（1:1，V:V），流速为4.7mL/min，进样量5mL，样品收集时间11min～15min。衍生化后样品按照上述条件净化，将约20mL收集液旋转蒸发至近干，用正己烷准确定容至5mL。4.4.5气相色谱条件气相色谱仪：附电子捕获检测器（ECD，Ni63）。色谱柱：HP-1MS石英毛细管色谱柱，φ30m×250μm×0.25mm。载气:高纯氮,纯度＞99.99％。载气流速：1.0mL/min。进样方式：不分流。程序升温：柱初始温度50℃,保持1min，以25℃/min速率升温至220℃,保持20min。进样口温度:250℃。检测器温度:300℃。4.4.6测定分别吸取2,4-滴经衍生化的标准工作液、试液各1.0μL注入气相色谱仪,按照4.4.5的条件进行检测，以保留时间定性，色谱峰面积外标法定量。标样及试样图谱见图5和图6。4.5计算按式（3）计算。X=A×C×V×2×1000（3）式中:X——2,4-滴残留量,单位为毫克每千克（mg/kgA——样液中2,4-滴(衍生物)峰面积；A0——标准工作溶液中2,4-滴(衍生物)峰面积；C——标准工作溶液中相当于2,4-滴(衍生物)浓度,单位为微克每毫升(μg/mLm——取样量，单位为克（gV——样液的定容体积，单位为毫升（mL）。4.6精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10％。4.7检测限7DB11/T379—2006在本试验条件下，豆芽中2,4-滴的定量检测限为0.002mg/kg。图52,4-滴标样色谱图图6豆芽样品中2,4-滴色谱图5赤霉素残留量的测定5.1原理豆芽中赤霉素经提取后，先经乙酸乙酯液液萃取初步净化，再利用凝胶渗透色谱（GPC）使目标化合物与基体干扰物分离，达到分离和净化的目的。用反相高效液相色谱法—DAD检测器进行色谱分析，采用标准物质的保留时间、辅助峰扫描光谱纯度对照两种方式对样品峰进行定性，采用外标法以峰面积计算定量。5.2试剂与材料5.2.1甲醇（AR）。5.2.2丙酮（AR）。5.2.3乙酸乙酯（AR）。5.2.450％硫酸溶液(V/V)。5.2.5pH2.5的酸性水溶液：用50％稀硫酸调节水的pH为2.5。8DB11/T379—20065.2.6无水硫酸钠（AR）。5.2.7冰乙酸（AR）。5.2.8固相萃取小柱：WatersSEP-PAK，用时先经10mL甲醇洗脱活化，再用10mL水洗去残留甲醇，保持萃取柱润湿状态待用。5.2.9赤霉素标准储备液：精密称取赤霉素（含量≥99.0%）0.1g（精确到0.0001g），用甲醇溶解并定容至100mL。此溶液浓度为每毫升相当于1.00mg赤霉素。5.2.10本标准所用水除另有规定外，均为蒸馏水。5.3仪器与设备5.3.1高效液相色谱仪（配DAD检测器）。5.3.2旋转蒸发仪。5.3.3组织捣碎机。5.3.4电动振荡器。5.3.5凝胶渗透色谱仪（GPC）。5.4分析步骤5.4.1试样制备称取捣碎后样品50g（精确到0.1g）于锥形瓶中，加20mL蒸馏水和100mL丙酮，震荡提取30min。混合物经布氏漏斗抽滤，残渣放回锥形瓶中，再用100mL丙酮震荡提取15min，用布氏漏斗抽滤,之后分别两次用50mL丙酮洗涤锥形瓶并倒在滤渣上，抽滤。将上述多次提取的丙酮-水提取液收集于1000mL圆底烧瓶中，在30℃水浴上，用旋转蒸发器减压蒸发除去丙酮。剩下的试样水溶液用滤纸过滤，用50mL蒸馏水洗涤烧瓶并通过同一滤器过滤，用20mL蒸馏水分别两次洗涤滤纸。将滤液转入烧杯中，用50%的硫酸溶液调至滤液pH为2.5±0.2。将样液转入250mL分液漏斗中，以少量蒸馏水洗涤烧杯。然后用150mL乙酸乙酯分3次提取样液，收集乙酸乙酯提取液，并通过约15g无水硫酸钠滤入250mL圆底烧瓶中，于30℃水浴中旋转蒸发至干。用15mL环己烷+乙酸乙脂（1：1）(V/V)混合液充分溶解，准备待分析样品溶液10mL，进入渗透色谱柱分离，作用时间13min，流速4.7mL/min。收集6min～13min的流出液。收集凝胶渗透色谱（GPC）流出液，于30℃水浴中旋转蒸发至干，再用2mL甲醇溶解；用0.45μm有机膜过滤后，供液相色谱分析。5.4.2标准溶液系列的配制准确吸取标准储备液0mL、0.50mL、1.00mL、1.50mL、2.00mL、5.00mL于100mL容量瓶中，用甲醇稀释定容至刻度。制成浓度依次为0μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、150μg/mL、200μg/mL、500μg/mL的标准溶液，供液相色谱分析。5.4.3色谱条件色谱柱：ZORBAXSB-C18柱：5μm，4.6mm×250mm（或相当型号色谱柱）。流动相：甲醇＋水（55＋45）(V/V)(溶液用冰乙酸调pH3.6)。流速：0.6mL/min。柱温：40℃。检测波长：206nm。5.4.4测定分别吸取5.0μL标准使用液和试样液注入高效液相色谱仪，按照5.4.3项条件进行检测，采用标准物质的保留时间辅助峰扫描光谱纯度对照两种方式对样品峰进行定性，采用外标法以峰面积计算定量。标样及样品中赤霉素图谱分别见图7和图8。5.5计算按式（4）计算。9DB11/T379—2006X=………………（4）X—样品中赤霉素的含量，单位为毫克每千克（mg/kgC—样品测定液中赤霉素的含量，单位为微克每毫升(μg/mLF—稀释倍数；m—样品量，单位为克（g）。计算结果保留两位有效数字。5.6精密度在重复条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。5.7检测限在本试验条件下，豆芽中赤霉素的定量检测下限为0.20mg/kg。图7赤霉素标样色谱图图8豆芽样品中赤霉素色谱图6福美双残留量的测定6.1原理豆芽中残留福美双与盐酸-氯化亚锡在密封反应瓶中共热放出二硫化碳，用气相色谱法（FPD）测定，以保留时间定性，外标法峰面积定量。6.2试剂与材料DB11/T379—20066.2.1盐酸（AR）。6.2.25mol/L盐酸溶液：量取42mL盐酸定容至100mL。6.2.3氯化亚锡（AR）。6.2.4二硫化碳（AR）。6.2.5二氯甲烷（AR）。6.2.6盐酸-氯化亚锡溶液：称取2gSnCl2·2H2O溶于100mL5mol/LHCl中。6.2.7处理水：经纯水制备系统制备的去离子水煮沸数分钟，冷却后待用。6.2.8福美双标准溶液：精密称取福美双（纯度≥98.022.4mg，以二氯甲烷溶解，并移入100mL容量瓶中，稀释至刻度。此溶液浓度为每毫升相当于224μg福美双。6.3仪器与设备6.3.1气相色谱仪：带火焰光度检测器（FPD）硫滤光片。6.3.2气密注射器：100µL。6.3.3恒温水浴或烘箱。6.3.4顶空瓶或具密封塞的250mL玻璃反应瓶。6.3.5组织捣碎机。6.3.6Milli-Q纯水制备系统。6.4分析步骤6.4.1试样制备称取20g（精确到0.1g）经组织捣碎机匀浆处理的豆芽样品放入反应瓶中，加处理水至30mL，加盐酸-氯化亚锡溶液40mL，塞紧反口胶塞，用反应瓶架固定。将反应瓶置于80℃的烘箱中反应2小时，每隔0.5小时摇动1分钟。反应完成后取出反应瓶，冷却至室温。抽取瓶内顶空气体进行定量测6.4.2标准曲线的制备分别准确吸取1µL、5µL、10µL、50µL福美双标准溶液于反应瓶中，瓶内福美双的量分别为0.224µg、1.12µg、2.24µg、11.2µg，按照6