DB22-T3440-2023-人粪便中华支睾吸虫虫卵检测PCR和实时荧光PCR法-吉林省

ICS07.00.01CCSC6222吉林省地方标准DB22/T3440—2023人粪便中华支睾吸虫虫卵检测PCR和实时荧光PCR法DetectionofClonorchissinensiseggsinhumanfeces-PCRandrealtimePCRmethods吉林省市场监督管理厅发布DB22/T3440—2023目次前言...........................................................................II1范围................................................................................12规范性引用文件......................................................................13术语和定义..........................................................................14缩略语..............................................................................15试剂、材料和引物....................................................................1试剂............................................................................1材料............................................................................2引物............................................................................26仪器和设备..........................................................................27样品采集............................................................................38核酸提取............................................................................39DNA的浓度和纯度测定................................................................310PCR检测...........................................................................4普通PCR检测..................................................................4实时荧光PCR检测..............................................................5附录A（资料性）试剂配制........................................................6附录B（规范性）华支睾吸虫虫卵特定的DNA序列....................................7IDB22/T3440—2023前言本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由长春海关提出并归口。本文件起草单位：吉林国际旅行卫生保健中心（长春海关口岸门诊部）、长春海关技术中心。本文件主要起草人：马文晨、孟庆峰、赵大力、王玮琳、刘金华、孟日增、王伟利。IIDB22/T3440—2023人粪便中华支睾吸虫虫卵检测PCR和实时荧光PCR法1范围本文件规定了人粪便中华支睾吸虫虫卵PCR和实时荧光PCR法的试剂、材料和引物，仪器和设备，样品采集，核酸提取，DNA的浓度和纯度测定，检测方法和结果判定。本文件适用于人粪便中华支睾吸虫虫卵核酸检测。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法34术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。缩略语55.1.1除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂。试验用水应符合GB/T6682中一级水的规定。1DB22/T3440—20235.1.2液氮。5.1.3EDTA缓冲液（0.5mol/L、pH8.0）。5.1.45.1.55.1.65.1.75.1.85.1.9CTAB提取缓冲液（2.0%）。CTAB沉淀液（0.5%）。蛋白酶K溶液（20mg/mL）。NaCl溶液（1.2mol/L）。三氯甲烷。三氯甲烷/异戊醇（24:1，V/V）。5.1.10异丙醇。5.1.1170%乙醇。5.1.12TE缓冲液。5.1.13加样缓冲液。5.1.14GoldenView核酸染料（或其他等效核酸染料）。5.1.15PremixTaq反应预混液（市售商品化PCR基础试剂）。5.1.16PremixExTaq（ProbeqPCR）（2×）反应预混液（市售商品化荧光PCR基础试剂）。5.1.17琼脂糖凝胶。5.1.181×TAE电泳缓冲液。试剂配制试剂配制参见附录A。材料5’-TATAGTTTGTCTGGGTAGGGTGGTT-3’5’-AACAGCAGTCCCCAAATCCA-3’62DB22/T3440—2023PCR仪。实时荧光PCR仪。电泳仪。凝胶成像系统。生物安全柜。离心机（离心力不小于12000g）。核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。移液器（2.5μL、10μL、20μL、100μL、200μL、1000μL）。研钵或冷冻粉碎装置。恒温水浴锅或干式恒温器。天平（感量0.01g）。高压灭菌器。7样品采集采集人体粪便，避免污染。样品应-20℃保存，冷藏运输，不能在24h内送达实验室的样品应冷冻状态运送。8核酸提取在生物安全柜内取200mg～500mg黄豆粒大小粪便，在液氮中充分研磨；或使用组织研磨仪对样品进行充分地研磨。取研磨后的样品200mg于2.0mL离心管中，加入1.5mLCTAB提取缓冲液（2.0%）和10μL蛋白酶K溶液，65℃孵育30min，期间每隔10min振荡混匀；12000g离心10min，转移上清于洁净的离心管中。加750μL三氯甲烷/异戊醇，混匀，12000g离心5min，转移上清液于洁净的离心管中。加2倍体积CTAB沉淀液（0.5%），室温静止60min，12000g离心15min，弃上清。加入350μLNaCl溶液将沉淀重悬浮。再加入350μL三氯甲烷，旋涡振荡进行混匀，12000g离心10min。转移上清后加入0.6倍体积的异丙醇用来沉淀核酸，室温放置20min，12000g离心10min，弃上清。加入100μLTE缓冲液或超纯水，溶解沉淀。立即使用或－20℃保存备用。可使用等效的商品化DNA提取试剂盒，按操作说明书进行操作。9DNA的浓度和纯度测定样品DNA使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计测定260nm和280nm处的吸光值A260和A280。DNA的浓度按式（1）进行计算:c=A×N×50··········································································(1)式中：3DB22/T3440—2023N——核酸稀释倍数。当DNA浓度高于10ng/μL，A260/A280比值在1.4～2.5之间时，可用于PCR检测和实时荧光PCR检测。10PCR检测普通PCR检测10.1.1反应体系按表3配制25μL反应体系，检测过程中设立阳性对照、阴性对照和空白对照，用合成的质粒作阳性对照，用不含目标基因的核酸做阴性对照，用水做空白对照。表3PCR反应体系成分PremixTaq用量（μL）12.5（含PCR缓冲液、dNTP、Mg、Tap酶）2+上游引物（10μmol/L）下游引物（10μmol/L）DNA模板1.01.05.05.5ddH2O水——第二阶段，94℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸30s，共30个循环；——第三阶段，72℃延伸5min，最后4℃保存。10.1.2.2反应体系浓度和反应条件可根据仪器和试剂不同作相应调整。10.1.3.1用1×TAE电泳缓冲液配制成1%琼脂糖凝胶，加入GoldenView核酸染料或其他等效核酸染料，浓度为5μL/50mL。将平板放入水平电泳槽中，加入1×TAE电泳缓冲液刚刚高出凝胶表面。10.1.3.2将PCR扩增产物5μL与1μL加样缓冲液混合后加入样品孔。在电泳时设立DNA标准分子量作对照，使用100bpDNA分子量标准。5V/cm恒压电泳30min～45min。10.1.4.1用凝胶成像系统进行分析。阳性对照扩增一条大小为231bp的特异性条带，阴性对照和空白对照应无该特异性条带；在阴性和阳性对照成立情况下，如被检样品无条带，则判定为华支睾吸虫虫卵核酸阴性，表述为“未检出华支睾吸虫虫卵核酸”；如被检样品有条带，大小为231bp，即判定为华支睾吸虫虫卵核酸阳性，表述为“检出华支睾吸虫虫卵核酸”。10.1.4.2必要时取PCR扩增产物进行序列测定，测序结果与附录B华支睾吸虫虫卵的DNA序列的符合程度在97%及以上的，判定为华支睾吸虫虫卵核酸阳性；符合程度在97%以下的，判定为华支睾吸虫虫卵核酸阴性。4DB22/T3440—202310.1.4.3如果出现与设计长度不同的条带，为非特异性反应，需重复试验，两次试验都为非特异性反应时，可判为阴性。实时荧光PCR检测10.2.1反应体系按表4配制25μL反应体系，检测过程中设立阳性对照、阴性对照和空白对照，用合成的质粒作阳性对照，用不含目标基因的核酸做阴性对照，用水做空白对照。表4实时荧光PCR反应体系成分用量（μL）PremixExTaq（ProbeqPCR）（2×）12.5（含PCR缓冲液、dNTP、Mg、Tap酶）2+上游引物（10μmol/L）下游引物（10μmol/L）探针（10μmol/L）DNA模板1.01.01.05.04.5ddH2O水10.2.2反应参数10.2.2.1将10.2.1中加样后的PCR管放入实时荧光PCR检测仪内。反应参数设置：——第一阶段，95℃30s；10.2.4.1无Ct值并且无扩增曲线，判定为华支睾吸虫虫卵核酸阴性，表述为“未检出华支睾吸虫虫卵核酸”。10.2.4.2检验样本Ct值≤35，出现典型的S型扩增曲线，判定为华支睾吸虫虫卵核酸阳性，表述为“检出华支睾吸虫虫卵核酸”。10.2.4.3检验样本35＜Ct值≤40时，重复一次，如果Ct值≤40时，并且出现典型S型扩增曲线，判定为华支睾吸虫虫卵核酸阳性，否则判定为华支睾吸虫虫卵核酸阴性。5DB22/T3440—2023附录A（资料性）试剂配制A.1EDTA缓冲液（0.5mol/L、pH8.0）：称取18.6gEDTA溶解于70mL水中，用10%的NaOH溶液，调节pH至8.0，加水定容至100mL，103.4kPa蒸汽压（121℃）条件下灭菌20min，室温保存。A.2Tris-HCl溶液（1mol/L、pH8.0）：12.1gTris，加80mL水溶解后，用浓HCl调节pH值到8.0，然后再定容到100mL，103.4kPa蒸汽压（121℃）条件下灭菌20min，室温保存。A.3Tris-HCl溶液（10mmol/L、pH8.0）：量取1mLTris-HCl溶液（1mol/L、pH8.0），加水稀释,调节pH8.0，,定容至100mL。A.4CTAB提取缓冲液（2.0%）：称取2gCTAB,取10mL的1mol/LTris-HCl（pH8.0），28mL的5mol/LNaCl，4mL的0.5mol/LEDTA（pH8.0），加水定容至100mL，103.4kPa蒸汽压（121℃）条件下灭菌20min，室温保存。A.5CTAB沉淀液（0.5%）：称取0.5gCTAB，取0.25gNaCl，用适量水溶解后，调节pH8.0，定容至100mL，103.4kPa蒸汽压（121℃）条件下灭菌20min，室温保存。A.6蛋白酶K溶液（20mg/mL）：称量0.2g蛋白酶冻干品，加无菌水溶解，加水定容至10mL，分装后于-20℃保存。A.7NaCl溶液（1.2mol/L）：称取8gNaCl溶解于80mL无菌水中，加