实验动物 小鼠脑脊髓炎病毒检测方法 征求意见稿

2GB/T14926.26—202X实验动物小鼠脑脊髓炎病毒检测方法本文件规定了小鼠脑脊髓炎病毒（TMEV）的检测方法。本文件适用于实验小鼠及其相关产品、实验动物环境样本、动物源性生物制品中TMEV的检测。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T14926.50实验动物酶联免疫吸附试验GB/T14926.51实验动物免疫酶试验GB/T14926.52实验动物免疫荧光试验GB/T14926.54实验动物血凝抑制试验GB19489实验室生物安全通用要求GB/T19495.2转基因产品检测实验室技术要求3原理3.1抗体检测原理根据免疫学原理，采用TMEV抗原检测小鼠血清中TMEV抗体；或根据TMEV在一定的条件下，能凝集人“O”型红细胞，这种凝集红细胞的能力可被特异性抗体所抑制的原理，检测小鼠血清中的TMEV抗体。3.2核酸检测原理根据小鼠脑脊髓炎病毒非编码蛋白（UTR）基因序列，设计合成一对特异性引物和一条特异性探针，探针两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'→3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，淬灭作用消失，荧光信号产生并被检测仪器接受，随着PCR反应的循环进行，PCR产物与荧光信号的增长呈对应关系。从而通过识别荧光信号对样本中的TMEV核酸进行检测。4主要试剂和器材4.1试剂：4.1.1ELISA抗原4.1.1.1特异性抗原3GB/T14926.26—202XTMEV（GDⅦ株）感染小鼠，待发病后无菌取脑，研磨，制成10%悬液，3000rpm离心10分钟后取上清液接种BHK21细胞，吸附1.5~2小时，加维持液培养4~5天左右，当细胞病变达++～+++时收获。冻融三次或超声波处理后，低速离心去除细胞碎片，上清液再经超速离心浓缩后制成ELISA抗原。4.1.1.2正常抗原BHK21细胞冻融破碎后，经低速离心去除细胞碎片而获得的上清液。4.1.2抗原片TMEV（GDⅦ株）感染BHK21细胞，培养4~5天，病变达++～+++时，将细胞用胰酶分散，用PBS洗涤，滴片。室温干燥后，冷丙酮固定10分钟，-20℃保存。4.1.3血凝素脑腔接种（0.02ml/只）14～21日龄小鼠5～7天后，无菌取脑，研磨，制成10%悬液，冻融2~3次，1000rpm离心10分钟，上清中加入等量的0.5%胰酶,，4℃可短期保存。4.1.4阳性血清TMEV病毒抗原免疫SPF小鼠所获得的抗血清。4.1.5阴性血清SPF小鼠血清。4.1.6酶结合物辣根过氧化物酶标记羊或兔抗小鼠IgG抗体；或辣根过氧化物酶标记葡萄球菌蛋白A（SPA）。4.1.7异硫氰酸荧光素标记羊或兔抗小鼠IgG抗体。4.1.8核酸检测试剂4.1.8.1经DEPC处理的无RNA酶水或商品无RNA酶水。4.1.8.2市售RNA抽提试剂盒4.1.8.3实时荧光RT-PCR基础反应液：市售商品化试剂4.1.8.4阳性对照：为含有TMEV病毒核酸的组织样本或细胞培养物。4.1.8.5阴性对照为不含TMEV病毒核酸的组织样本或细胞培养物。4.1.8.6根据表1的序列合成引物和探针，引物和探针配制成10μmol/L储备液，-20℃保存。表1实时荧光RT-PCR扩增引物和探针4GB/T14926.26—202X4.2器材4.2.1酶标仪4.2.2荧光显微镜4.2.3普通显微镜4.2.437℃培养箱或水浴箱4.2.5实时荧光PCR仪、PCR仪4.2.6高速冷冻离心机。4.2.7普通离心机。4.2.8组织匀浆器4.2.9生物安全柜。4.2.10PCR超净工作台。4.2.11微量移液器（0.1~2μL，1~10μL，10~100μL，100~1000μL）。4.2.12无RNase的离心管（1.5mL、2mL、5mL、15mL），无RNase的吸头（10μL，200μL，1mL），无RNase的PCR扩增反应管（0.2mL，八连管或96孔板）。4.2.13采样工具：剪刀、镊子和灭菌棉拭子等。5检测方法5.1生物安全措施实验操作及处理按照GB19489的规定，由具备相关资质的工作人员进行相应操作。5.2采用ELISA方法（见GB/T14926.50）进行血清学检测，或使用经验证的等效商品化试剂盒，按照试剂盒说明书进行操作。5.3采用IFA方法（见GB/T14926.52）进行血清学检测，或使用经验证的等效商品化试剂盒，按照试剂盒说明书进行操作。5.4采用IEA方法（见GB/T14926.51）进行血清学检测，或使用经验证的等效商品化试剂盒，按照试剂盒说明书进行操作。5.5采用HAI方法（见GB/T14926.54）进行血清学检测，或使用经验证的等效商品化试剂盒，按照试剂盒说明书进行操作。5GB/T14926.26—202X5.6采用实时荧光PCR方法（见附录A）进行TMEV核酸检测，或使用经验证的等效商品化试剂盒，按照试剂盒说明书进行操作。6结果判定6.6.1抗体检测结果判定对阳性或可疑结果，选用同一种抗体检测方法或另一种抗体检测方法复测。如仍为阳性则判为阳性。6.26.2核酸检测结果判定对阳性或可疑结果，用同一种核酸检测方法复测，或取可疑阳性样本PCR产物进行核酸序列测定，如仍为阳性，则判为阳性。7结果报告根据判定结果，作出报告。6GB/T14926.26—202X（规范性附录）小鼠脑脊髓炎病毒核酸检测方法A.1采样及样本的处理采样过程中样本不得交叉污染，采样及样本前处理过程中须戴一次性手套A.1.1脏器组织活体动物采用安乐死方法进行处死，剖检，无菌采集动物的肠系膜淋巴结、肝脏、脾脏和肠，待检样品按照5倍比例加入灭菌PBS，组织匀浆器充分匀浆3~5分钟，离心取上清液转入另一无菌离心管中，编号备用。A.1.2盲肠内容物或粪便无菌采集动物盲肠内容物或粪便，按照5倍比例加入灭菌PBS，充分匀浆，离心取上清液转入另一无菌离心管中，编号备用。A.1.3细胞培养物将接种后出现CPE或可疑的细胞培养物反复冻融三次，细胞混悬液转移于15mL离心管中，12000r/min离心10min，去细胞碎片，上清液转移到无菌15mL离心管中，编号备用。A.1.4实验动物环境样本A.1.4.1实验动物饲料、垫料和饮水取适量实验动物饲料和垫料置于聚乙烯薄膜袋中，加入10倍体积灭菌PBS（饲料和垫料需全部浸泡于液体中）。密封后浸泡5~10min，充分混匀，将混悬液转移至15mL离心管中，4℃,12,000rpm离心10min，取上清液转入另一无菌5mL离心管中，编号备用。取适量实验动物饮水直接转移到无菌5mL离心管中，编号备用。A.1.4.2实验动物设施设备用灭菌棉拭子拭取实验动物设施设备出风口初效滤膜表面沉积物，将拭子置入灭菌15mL离心管，加入适量灭菌PBS，浸泡5~10min，充分混匀，取出棉拭子，将离心管于4℃,12,000rpm离心10min，取上清液转入另一无菌5mL离心管中，编号备用。A.1.5样本的存放采集或处理的样本在2~8℃条件下保存应不超过24h，若需长期保存，须放置-80℃冰箱，但应避免反复冻融（冻融不超过3次）。7GB/T14926.26—202XA.2病毒核酸提取选择市售商品化RNA提取试剂盒。按照试剂盒操作说明书提取样品中的RNA。在提取RNA时应设立阳性和阴性对照样品，按同样方法提取RNA。RNA的提取操作应在生物安全柜中进行，避免RNA气溶胶的污染。制备好的RNA应尽快进行下一步PCR反应，若暂时不能进行PCR反应，应于-80℃冰箱保存备用。A.3实时荧光RT-PCRA.3.1反应体系一步法实时荧光RT-PCR反应体系见表2。反应液的配制在冰上操作，每次反应同时设计阳性对照、阴性对照和空白对照，其中阳性对照以含有TMEV的组织或细胞培养物提取的RNA作为阳性对照模板，其中阴性对照以不含有TMEVRNA样本（可以是正常动物组织或正常细胞培养物）作为阴性对照模板，空白对照即为不加模版对照（NoTemplateControl，NTC即在反应中用水来代替模板。表2每个样本反应体系配制表111118A.3.2反应参数实时荧光RT-PCR反应参数见表3：表3：实时荧光RT-PCR反应参数否18GB/T14926.26—202X1是试验检测结束后，根据收集的荧光曲线和Ct值判定结果。A.4实时荧光PCR结果判定A.4.1结果分析和条件设定直接读取检测结果，基线和阈值设定原则根据仪器的噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过正常阴性样品样本扩增曲线的最高点为准。A.4.2质控标准A.4.2.1空白对照无Ct值，并且无荧光扩增曲线。A.4.2.2阴性对照无Ct值，并且无荧光扩增曲线。A.4.2.3阳性对照Ct值应≤35，并且有明显的荧光扩增曲线，则表明反应体系运行正常，否则此次试验无效，需重新进行实时荧光PCR扩增。A.4.3结果判定A.4.3.1若待检样品无荧光扩增曲线，则判定样品TMEV病毒核酸阴性。A.4.3.2若待检样品有荧光扩增曲线，且Ct值≤35时，则判断样品TMEV病毒核酸阳性。A.4.3.3若待检样品Ct值介于35和40之间时，应重新进行实时荧光PCR检测。重新检测后，若Ct值≥40时，则判