实验动物 小鼠肺炎病毒检测方法 征求意见稿

本文件规定了小鼠肺炎病毒（PVM）的检测方法。下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。根据免疫学原理，采用PVM抗原检测小鼠、大鼠、地鼠、豚鼠血清中PVM抗体。4.1试剂:PVM感染小鼠待发病后取肺脏，研磨，制成10%悬液，3000r/min离心10min后取上清液感染处理后，低速离心去除细胞碎片，上清液再经超速离心浓缩后制成ELISA抗原。BHK21细胞冻融破碎后，经低速离心去除细胞碎片而获得的上清液。4.1.2抗原片涂片。室温干燥后，冷丙酮固定10min，-20℃保存。PVM免疫清洁或SPF小鼠、大鼠、豚鼠、地鼠所获得的抗血清。辣根过氧化物酶标记葡萄球菌蛋白A(SPA)可用于小鼠、豚鼠、地鼠血清抗体的检查。表1实时荧光RT-PCR扩增引物和探针GCAAGGACACTCGGCATGTTGGAGCCCTATTTCTGCCACFAM-CTTACTTACTGCCTTCAACCGTTGCGAAGA-BHQ-1714.2器材5.4采用荧光定量PCR方法（见附录A）进行核酸检测。则判为PVM抗体阳性。典型扩增曲线，判为可疑，需复检，复检仍出现35＜Ct值≤40，并且曲线有明显的对数为阳性；否则判为阴性。无Ct值或Ct值＞40且无特征性扩增曲实验动物小鼠肺炎病毒核酸检测方法A.1主要设备和材料A.1.1实时荧光PCR仪A.1.2Nanodrop紫外分光光度计。A.1.3高速冷冻离心机A.1.4台式离心机。A.1.5恒温孵育器。A.1.6漩涡振荡器。A.1.7组织匀浆器或手持式均质器。A.1.8生物安全柜。A.1.9PCR工作台。A.1.10-80℃冰箱，-20℃冰箱，2~8℃冰箱。A.1.11微量移液器（10μL，100μL，100A.1.12无RNase和DNase的离心管（1.5mL、2mL、5mL、15mL），无RNase和DNase的吸头（10μL，200μL，1mL），无RNase和DNase的PCR扩增反应管。A.2试剂A.2.10.02mol/LpH7.2磷酸盐缓冲液（PBS）0.2mol/L磷酸二氢钠溶液：称取磷酸二氢钠（NaH2PO4・H20）27.6g，先加适量去离子水溶解，最后定容至1000mL，混匀。A.2.1.2B液0.2mol/L磷酸氢二钠溶液：称取磷酸氢二钠NaH2PO4·7H2O53.6g（或Na2HPO4·12H2O71.6g或Na2HPO4·2H2O35.6g），先加适量去离子水溶解，最后定容至1000mL，混匀。A.2.1.30.02mol/LpH7.2磷酸盐缓冲液（PBS）的配制取A液14mL，B液36mL，加氯化钠（NaCl）8.5g，加800mL去离子水溶解稀释，用HCl调pH至7.2，最后定容至1000mL，经121℃高压灭菌15min，冷却备用。A.2.2无DNase/RNase去离子水实验用去离子水按体积比0.1%加入DEPC摇匀，室温静置过夜，121℃高压灭菌15min，冷却备用。A.2.3RNA抽提试剂TRIzol或其他等效产品。A.2.4无水乙醇。A.2.575%乙醇（无DNase/RNase去离子水配制）。A.2.6三氯甲烷（氯仿）。A.2.7异丙醇。A.2.8引物和探针：根据表1的序列合成引物和探针，引物和探针加无RNase去离子水分别配制成10μmol/L储备液，-20℃保存。A.3样本的采集A.3.1脏器组织将活体动物安乐死后剖检，无菌采集动物的肺、肠系膜淋巴结、肝脏、或脾脏，剪取待检样品2.0g于无菌离心管。A.3.2盲肠内容物或粪便无菌采集动物盲肠内容物或粪便，取待检样品2.0g于无菌离心管中。A.3.3实验接种物直接取待测细胞培养物、肿瘤组织等待测实验接种物于无菌离心管中。A.3.4实验动物环境样本取适量实验动物饲料和垫料置于无菌样品袋中；取适量实验动物饮水直接转移到无菌离心管中；用无菌拭子拭取实验动物笼具出风口初效滤膜表面粉尘装入无菌离心管中；取笼具系统内置的出风口粉尘吸附介质装入无菌离心管中；用无菌拭子拭取实验动物环境中的待测位置后装入无菌离心管中。A3.5样本的运输和存放样本采集后应密封、加冰并尽快运送到检测实验室。在2~8℃条件下暂存应不超过24h，若不能立即检测应-20℃保存，若需长期保存，须置于-80℃冰箱，但应避免反复冻融（冻融不超过3次）。A.4样本RNA提取使用TRIzol或其他等效产品提取RNA，TRIzol对人体有害，使用时应戴一次性手套，注意防止溅出。A.4.1取200μL处理后的样本加1mLTRIzol后，充分混匀，室温静置10min使其充分裂解。A.4.2按每毫升TRIzol加入200μL氯仿，盖紧样本管盖，用手用力振荡摇晃离心管15s；不应用漩涡振荡器，以免基因组RNA断裂。室温静置5min。4℃、12A.4.3离心后混合物分成三层：下层红色的苯酚-氯仿层，中间层，上层无色的水样层。RNA存在于水样层当中，水样层的容量大约为所加TRIzol容量的60%。吸取上层水相至另一离心管中，注意不要吸取中间界面。A.4.4按每毫升TRIzol加入0.5mL异丙醇异丙醇混匀，室温放置10min。4℃12000r/min离心10min，弃上清，RNA沉淀一般形成一胶状片状沉淀附着于试管壁和管底。A.4.5按每毫升TRIzol加入1mL75%乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀。4℃7500r/min离心5min，弃上清，将离心管倒立吸水纸上，尽量使液体流干。A.4.6室温自然风干干燥5~10min，RNA样本不要过于干燥。A.4.7用50~100μL无RNase去离子水溶解RNA样品，制备好的RNA应尽快进行下一步PCR反应；若暂时不能进行PCR反应，应于-80℃冰箱保存备用。A.5实时荧光RT-PCR实时荧光RT-PCR反应体系见表6。反应液的配制在冰上操作，每次反应同时设置阳性对照、阴性对照和空白对照。1)反应体系见表2。总体系50μL。表2：荧光RT-PCR反应体系配制表反应组份用量/μL终浓度2×OneStepRT-PCRBufferⅢ25ExTagHS(5U/μL)1/PrimeScriptRTEnzymeMixⅡ1/ForwardPrimer(10μM)2.5500nMReversePrimer(10μM)2.5500nMProbe(5μM)2250nMRox1/TotalRNA/无RNase去离子水5/实时荧光RT-PCR反应参数见表3。表3：荧光RT-PCR反应参数表步骤温度采集荧光信号循环数逆转录42℃5min否1预变性95℃30sec否1变性95℃5sec否退火，延伸60℃34sec是40相应调整。试验结束后，根据收集的荧光曲线和Ct值判定结果。A.5.3实时荧光RT-PCR结果判定直接读取检测结果，基线和阈值设定原则根据仪器的噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过正常阴性样品扩增曲线的最高点为准。质控标准：空白对照无Ct值，且无荧光扩增曲线，一直为水平线；阴性对照无Ct值，且无荧光扩增曲线，一直为水平线；阳性对照Ct值≤35，且有明显的荧光扩增曲线，则满足质控要求；否则此次试验无效，需重测。A.5.3.1质控成立条件下，若待检测样本无荧光扩增曲线，则判定为阴性。A.5.3.2质控成立条件下，若待检测样本有荧光扩增曲线，且Ct值≤35