实验动物 鼠痘病毒检测方法 征求意见稿

2GB/T14926.20—202X实验动物鼠痘病毒检测方法本文件规定了鼠痘病毒（EctromeliaVirus,ECTV）的检测方法。本文件适用于实验动物鼠痘病毒的检测，或实验接种物、实验鼠环境和鼠源性生物制品中鼠痘病毒的检测。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T14926.50实验动物酶联免疫吸附试验GB/T14926.51实验动物免疫酶试验GB/T14926.52实验动物免疫荧光试验GB/T14926.55实验动物免疫酶组织化学法GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求GB/T19495.2转基因产品检测实验室技术要求SN/T4918-2017《鼠痘检疫技术规范》3原理酶联免疫吸附试验（ELISA）/免疫酶试验（IEA采用ECTV抗原检测鼠血清中ECTV抗体，两者形成的抗原抗体复合物可与相应的酶标二抗结合，在酶的催化作用下底物发生反应，产生有色物质。颜色反应的深浅与待检血清中所含有的ECTV抗体的量成正比。免疫荧光试验（IFA）：采用ECTV抗原检测鼠血清中ECTV抗体，两者形成的抗原抗体复合物可与相应的荧光素标记的二抗结合，在紫外光或蓝紫光的照射下，激发出可见的荧光，在荧光显微镜下以荧光的有无和强弱判定结果。3GB/T14926.20—202X免疫酶组织化学法（IH采用已知的ECTV特异性抗体与标本中待测抗原反应，如待测抗原是特异性抗体的相应抗原则形成抗原抗体复合物。此抗原抗体复合物仍保持其抗原活性，可与相应的第二抗体酶结合物结合，遇酶底物产生颜色反应。在普通显微镜下，根据颜色的反应判定结果。核酸检测：根据鼠痘病毒保守序列基因，设计合成一对特异性引物和一条特异性探针序列，提取样本中的鼠痘病毒DNA，通过实时荧光PCR对模板DNA进行扩增，根据实时荧光PCR检测结果判定该样品中是否含有病毒核酸成分。4主要试剂和器材4.1主要试剂4.1.1ELISA抗原4.1.1.1特异性抗原用ECTV感染BHK21细胞，当病变达+++~++++时收获。冻融三次或超声波处理后，低速离心去除细胞碎片，上清液再经超速离心浓缩后制成EIASA抗原。4.1.1.2正常抗原BHK21细胞冻融破碎后，经低速离心去除细胞碎片而获得的上清液。4.1.2抗原片ECTV感染BHK21细胞，接种后2~3d，病变达++~+++时用胰酶消化分散，PBS洗涤，涂片。室温干燥后，冷丙酮固定10min，-20℃保存。4.1.3阳性血清用灭活ECTV抗原，免疫SPF小鼠所获得的抗血清。4.1.4阴性血清SPF小鼠血清。4.1.5酶结合物辣根过氧化物酶标记羊或兔抗小鼠IgG抗体；或辣根过氧化物酶标记葡萄球菌蛋白A。4.1.6荧光标记物异硫佩酸荧光素标记羊或兔抗小鼠IgG抗体。4GB/T14926.20—202X4.1.7引物和探针表1实时荧光PCR扩增引物和探针注：探针也可选用具有与FAM和BHQ-1荧光基团相同检测效果的其他合适的荧光报告基团和荧光淬灭基4.1仪器与器材4.2.1酶标仪。4.2.2荧光显微镜。4.2.3普通显微镜。4.2.437℃培养箱或水浴箱。4.2.5石蜡切片机或冷冻切片机。4.2.6实时荧光定量PCR仪。5检测方法5.1生物安全措施实验操作及处理按照GB19489的规定，由具备相关资质的工作人员进行相应操作。5.2实验室总体技术要求实验室总体技术要求和检验质量控制的基本要求参考GB/T19495.2的规定。5.3采样及样本的处理采样及样本处理见本文件附录A，采样过程中样本不得交叉污染，采样及实验过程中须戴一次性手套。5.4采用ELISA方法（见GB/T14926.50）进行血清学检测，或按照等效商业化ELISA试剂盒说明书进行检测。5.5采用IFA方法（见GB/T14926.52）进行血清学检测，或按照等效商业化IFA试剂盒说明书进行检测。5GB/T14926.20—202X5.6采用IEA方法（见GB/T14926.51）进行血清学检测，或按照等效商业化IEA试剂盒说明书进行检测。5.7采用IH法（见GB/T14926.55）进行病毒抗原检测，或按照等效商业化IH试剂盒说明书进行检测。5.8采用实时荧光PCR方法（见附录A）进行核酸检测，或按照等效商业化实时荧光PCR试剂盒说明书进行检测。6结果判定6.1ELISA/IFA/IEA对阳性检测结果，选用同一种方法或另一种方法重试。如仍为阳性则判为阳性。6.2IH对照片本底清晰，背景无非特异着染，被检物呈黄至徐褐色着染，即可判为阳性。6.3实时荧光PCR结果判定对阳性或可疑结果，用同一种方法重试。如仍为阳性或可疑，则判为阳性。7结果报告根据判定结果，出具报告。6GB/T14926.20—202X（规范性附录）鼠痘病毒实时荧光PCR检测方法A.1主要设备和材料A.1.1实时荧光PCR仪。A.1.2Nanodrop紫外分光光度计。A.1.3高速冷冻离心机。A.1.4台式离心机。A.1.5恒温孵育器。A.1.6漩涡振荡器。A.1.7组织匀浆器或手持式均质器。A.1.8生物安全柜。A.1.9PCR工作台。A.1.102-8℃冰箱，-20℃冰箱，2-8℃冰箱。A.1.11微量移液器（10μL，100μL，1000μLA.1.12无RNase和DNase污染的离心管（1.5mL、2mL、5mL、15mL），无RNase和DNase污染的吸头（10μL，200μL，1mL），无RNase和DNase污染的PCR扩增反应管。A.1.13采样工具：剪刀、镊子、注射器等。A.2试剂除特别说明外，以下实验用试剂均为分析纯；实验用水为去离子水。A.2.1无DNase/RNase去离子水实验用去离子水按体积比0.1%加入DEPC摇匀，室温静置过夜，121℃高压灭菌15min，冷却备用。A.2.2实时荧光PCR试剂盒或等效试剂盒。A.2.3引物和探针：根据表1的序列合成引物和探针，引物和探针加无RNase去离子水分别配制成20μmol/L储备液，-20℃保存。A.3样本的采集、处理和存放A.3.1动物相关样本和脏器组织活体动物可采集疑似病变部位的拭子、痂皮等样本装入无菌离心管中编号备用。也可将动物安乐死后无菌采集动物的肝脏、脾脏、疑似病变皮肤组织等相关脏器，剪取待检样品1.07GB/T14926.20—202Xg于无菌5mL离心管，加入4mL灭菌PBS，使用电动匀浆器充分匀浆1~2min，然后将组织悬液在4℃、3000r/min离心10min，取上清液转入另一无菌5mL离心管中，编号备用。A.3.2盲肠内容物或粪便无菌采集取约1g的盲肠内容物或1~2颗粪便置于无菌5mL离心管，加入4mL灭菌PBS，使用电动匀浆器充分匀浆1~2min，12000r/min离心10min，取上清液转入另一无菌5mL离心管中，编号备用。A.3.3细胞培养物方法一：直接刮取样品接种后出现CPE或可疑的细胞培养物于15mL离心管中，3000r/min离心10min，去上清，加1mL灭菌PBS重悬细胞，然后将细胞悬液转移到无菌1.5mL离心管中，编号备用。方法二：将样品接种后出现CPE或可疑的细胞培养物反复冻融三次，细胞混悬液转移于15mL离心管中，12000r/min离心10min，去细胞碎片，上清液转移到无菌15mL离心管中，编号备用。A.3.4实验动物环境A.3.4.1实验动物饲料、垫料和饮水取适量实验动物饲料和垫料置于无菌容器中，加入适量灭菌PBS（饲料和垫料需全部浸泡于液体中）。密封后浸泡5~10min，充分混匀，将混悬液转移至15mL离心管中，4℃,12,000r/min离心10min，取上清液转入另一无菌5mL离心管中，编号备用。取适量实验动物饮水直接转移到无菌5mL离心管中，编号备用。A.3.4.2实验动物设施设备使用适当的采样工具拭取实验动物设施出风口滤膜上的沉积物，将拭子置入灭菌15mL离心管，加入适量灭菌PBS，浸泡5~10min，充分混匀，取出棉拭子，将离心管于4℃,12000r/min离心10min，取上清液转入另一无菌5mL离心管中，编号备用。A.3.5样本的存放采集或处理的样本在2~8℃条件下保存应不超过24h，若需长期保存，须放置-80℃冰箱，但应避免反复冻融（冻融不超过3次）。A.4样本DNA提取A.4.1取50~100μL的样本至1.5mL或2mL离心管中，加20μL蛋白酶K，用PBS补加至220μL。A.4.2加入200μL缓冲液AL，涡旋震荡充分混匀，56℃孵育10min。8GB/T14926.20—202XA.4.3加入200μL的无水乙醇，涡旋震荡充分混匀。A.4.4移取步骤C.1.3的混合液至离心柱上，离心柱放在2mL收集管上。≧6000g（8000r/min）离心1min。弃收集管/液。A.4.5离心柱放至新的2mL收集管上，加500μL的缓冲液AW1，≧6000g（8000r/min）离心1min。弃收集管/液。A.4.6离心柱放至新的2mL收集管上，加500μL的缓冲液AW2，20000g（14000r/min）离心3min。弃收集管/液。A.4.7将离心柱放在一个新的1.5mL离心管上，吸取200μL的缓冲液AE在吸附膜上，室温孵育1min，≧6000g（8000r/min）离心1min。制备好的DNA应尽快进行下一步PCR反应；若暂时不能进行PCR反应，应于-20℃冰箱保存备用。DNA提取试剂盒进行，提取方法可进行A.5实时荧光PCRA.5.1实时荧光PCR反应体系实时荧光PCR反应体系见表2。反应液的配制在冰上操作，每次反应同时设计阳性对照、阴性对照和空白对照。表2实时荧光PCR反应体系反应组分用量/μL终浓度PremixExTaq(ProbeqPCR)(2×)PCRForwardPrimer(10μM)0.40.2μMPCRReversePrimer(10μM)0.40.2μMProbe(5μM)0.8RoxReferenceDye(50×)0.4DNA模板2灭菌水620A.5.2实时荧光PCR反应参数实时荧光PCR反应参数见表3。试验检测结束后，根据收集的荧光曲线和Ct值判定结9GB/T14926.20—202X表3实时荧光PCR反应参数步骤温度循环数采集荧光信号预变性95℃30s1否变性95℃40否退火，延伸60℃31s是b）可使用其他等效的实时荧光PCR检测试剂盒进行，反应体系和反应参数可做相A.5.3实时荧光PCR结果判定A.5.3.1结果分析和条件设定直接读取检测结果，基线和阈值设定原则根据仪器的噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过正常阴性样品扩增曲线的最高点为准。A.5.3.2质控标准空白对照无Ct值，并且无荧光扩增曲线，一直为水平线。阴性对照无Ct值，并且无荧光扩增曲线，一直为水平线。阳性对照Ct值应≤35，并且有明显的荧光扩增曲线，则表明反应体系运行正常，否则此次试验无效，需重新进行实时荧光PCR扩增。A.