DB22-T2078-2014-鹿源结核杆菌基因分型MLVA法-吉林省

ICS11.220B41DB22吉林省地方标准DB22/T2078—2014鹿源结核杆菌基因分型MLVA法MLVAMethodforGenotypingofMycobacteriumTuberculosisfromDeer吉林省技术质量监督局发布DB22/T2078—2014前言本标准按照GB/T1.1-2009和GB/T20001.4-2001给出的规则起草。本标准由中华人民共和国吉林出入境检验检疫局提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国吉林出入境检验检疫局、吉林农业大学、吉林省中韩动物科学研究院。本标准主要起草人：王春雨、杨莉、李忠平、石建平、王全凯、孙磊、宋立品、孔德鑫。IDB22/T2078—2014鹿源结核杆菌基因分型MLVA法1范围本标准规定了鹿源结核杆菌MLVA分型方法。本标准适用于鹿源结核杆菌MLVA基因分型。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求SN/T2025动物检疫实验室生物安全操作规范3缩略语3.1MLVA:多位点可变数目串联重复序列分析3.2DNAmarker：脱氧核糖核酸分子标记3.3SDS:十二烷基硫酸钠3.5Tris-HCl:三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液3.6EDTA：乙二胺四乙酸多位点数目可变串联重复序列分型(multiplelocusVNTRsanalysis，MLVA)以PCR扩增为基础，利用PCR方法扩增散在于菌株基因组中的不同独立位点可变数目串联重复序列(VNTR)，对扩增产物进行DNA分析确定长度，根据不同位点重复序列单拷贝长度计算出拷贝数，由不同位点拷贝数组成菌株基因型。1DB22/T2078—20146.310%SDS：10g的SDS粉末溶解于70ml双蒸水中，定容到100ml。6.4PCR扩增预混液6.51MTris-HCl(pH8.0):称取Tris碱6.06g，加双蒸水40ml溶解，滴加浓HCl调pH至8.0，定容至50ml。6.60.5MEDTA(pH8.0):称取EDTA-Na2·2H2O9.306g，加双蒸水35ml，搅拌，用NaOH调pH至8.0，定容至50ml。6.7苯酚/三氯甲烷/异戊醇（体积比25；24；1）6.8三氯甲烷6.9CTAB裂解液：2％CTAB，1.4mol/LNaCl，0.1mol/LTris-HCl(pH8.0)，0.02mmol/LNa2-EDTA(pH8.0)。6.10CTAB沉淀液：0.5％CTAB，0.04mmol/LNaCl。6.11TE缓冲液:称取1MTris-HCl(pH8.0)1ml和0.5MEDTA(pH8.0)0.2ml，加加双蒸水定容至100ml。6.12PCR引物本规程选择13个MLVA位点作为扩增位点，各位点引物见表1，引物保存于-20℃，临用前取出用双蒸水稀释为10pmol/μl，置-20℃保存。表1MLVA位点扩增引物引物名称QUB-11baQUB-11bbMIRU4aMIRU4bMIRU40aMIRU40bMIRU31aMIRU31bMtub4a碱基数24181919222424192523242423252020182823252424222524AACGCTCAGCTGTCGGATMtub34MIRU22DB22/T2078—2014MIRU2bTACTCGGACGCCGGCTCAAAAT227仪器与设备7.1生物安全柜7.2梯度PCR仪7.3毛细管电泳分析系统7.4高速冷冻离心机：最高离心力可达15000×g以上7.5高压灭菌器7.6涡漩振荡器7.7移液器8操作步骤8.1DNA提取8.1.1将结核杆菌置高压灭菌器中121℃下15min灭活，取2-3个菌落或50μl菌液放入离心管中，加入200μlTE缓冲液，加10%SDS至终浓度为1%，置85℃～90℃水浴10min。8.1.2加入1.0mLCTAB裂解液及50µL蛋白酶K溶液，涡旋震荡30s后，颠倒混合5次，65℃水浴过夜（12h-16h）。8.1.3室温12000r/min离心10min，取上层溶液800µL，加入等体积的Tris饱和酚/三氯甲烷/异戊醇（25:24:1，v/v/v），轻轻颠倒离心管混匀，室温12000r/min离心10min；取上层清液(水相)于一新离心管中，加入等体积的三氯甲烷/异戊醇（24:1，v/v），颠倒混匀，室温12000r/min离心10min，取上清液600µL，加入2倍体积的CTAB沉淀液，混匀，室温静置60min。12000r/min离心15min，弃上清液。加入500µL氯化钠溶液溶解沉淀，然后加入500µL三氯甲烷，振荡混匀，12000r/min离心10min，将上清液移至一新离心管，加入0.6倍体积的异丙醇，混匀，4℃静置30min，4℃，12000r/min离心10min，小心弃去上清液，向沉淀加入500µL70%冷乙醇，洗涤沉淀，4℃，12000r/min离心5min，小心倒出上清液，室温干燥后，将DNA溶于50µL去离子水中，-20℃保存。也可使用等效的商品化试剂盒提取模板DNA。取5µLDNA溶液加二次蒸馏水稀释至1mL，使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计分别检测260nm和280nm处的吸光值A260和A280。DNA的浓度按式（1）计算：.................................(1)式中：3DB22/T2078—2014PCR反应体系确定为：DNA0.5μl、上下游引物(10pmol/L)各0.2μl、PCR扩增预混液10μl、双蒸水9.1μl。8.4PCR扩增不同位点PCR扩增条件详见表2。表2不同MLVA位点PCR扩增反应条件位点反应条件第二步循环数MIRU4MIRU23第一步95℃15min第二步94℃1min，59℃1min40MIRU31MIRU39MIRU40MIRU272℃1min30s第三步72℃10minETRAQUB-11bQUB-26第一步95℃12min第二步94℃30s60℃1min404072℃2min第三步72℃7minMtub34Mtub30Mtub21Mtub4第一步95℃15min第二步94℃1min50℃1min以50bpDNAmarker为标准，各位点的PCR产物经毛细管电泳检测，确定PCR产物片段大小，毛细管电泳条件如下：加样体积：5μl；电压：100～240V，50/60Hz；工作温度：10℃～30℃；工作湿度：10%～75%；用毛细管电泳检测的PCR产物长度减去对应上下游引物的长度，再除以对应位点的单拷贝片段长度，所得结果即为重复区序列的拷贝数。各重复区单拷贝片段长度大小见表3。表3MLVA各位点重复序列单拷贝长度位点单拷贝长度单拷贝长度MIRU4MIRU31MIRU39MIRU40MIRU234DB22/T2078—2014MIRU2ETRA5375QUB-261119结果分析将PCR产物长度换算为重复序列拷贝