DB22-T2911-2018-贝类中副溶血性弧菌检测微滴数字PCR法-吉林省

ICS67.120.30DB22B50吉林省地方标准DB22/T2911—2018贝类中副溶血性弧菌检测微滴数字PCR法DeterminationofVibrioParahemolyticusinshellfish-dropletdigitalPCRmethod吉林省市场监督管理厅发布DB22/T2911—2018前言本标准按照GB/T1.1-2009和GB/T20001.4-2015给出的规则起草。本标准由长春海关（原吉林出入境检验检疫局提出并归口）。本标准起草单位：长春海关（原吉林出入境检验检疫局验检疫技术中心）、吉林大学中日联谊医院、吉林农业大学。本标准主要起草人：聂丹丹、聂海英、王宁宁、杜佳剑、曲辉、彭勃、王玮琳、刘金华、罗雁非、洪晓坤。IDB22/T2911—2018贝类中副溶血性弧菌检测微滴数字PCR法警示——使用本标准的人员应有正规实验室工作的实践经验。本标准并未指出所有可能的安全问题。使用者有责任采取适当的安全和健康措施，并保证符合国家有关法规规定的条件。1范围本标准规定了贝类中副溶血性弧菌检测微滴数字PCR法的试剂和材料、仪器和设备、样品、试验步骤和试验数据处理与防止污染措施。本标准适用于贝类中副溶血性弧菌检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB4789.1-2016食品安全国家标准食品卫生微生物检验总则GB4789.7-2013食品安全国家标准食品微生物学检验副溶血性弧菌检验GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3原理微滴式数字PCR平台通过产生微小油包水体系实现反应体系的分割，根据副溶血性弧菌的旋转酶（gyrase）特异性基因序列对贝类中副溶血性弧菌进行鉴定。经PCR扩增后，根据泊松分布原理及阳性微滴的个数与比例即可得出靶分子的起始拷贝数或浓度，实现对副溶血性弧菌的快速定性检测。除另有规定外，所有试剂均为分析纯。实验用水符合GB/T668中二级水的要求。4.1裂解液,成分包括：2%CTAB(cetyltrithylammoniumbromide，十六烷基三甲基溴化铵)，100mmol/LTris(trishydroxymethylaminomethane，三羟甲基氨基甲烷)，1.4mol/LNaCl，20mmol/L1DB22/T2911—20184.770%乙醇。4.82×ddPCR预混液。4.9副溶血性弧菌旋转酶（gyrase）基因引物和探针4.10上游引物：5’-CGGTAGTAAACCCACTGTCAG-3’下游引物：5’-GTTTCAGGCTCACCATGACG-3’探针：5’-（FAM）-ATCCATCGTGGCGGTCATATCCAC-（TAMRA）-3’4.11菌株：副溶血性弧菌阳性标准菌株。5仪器和设备5.1微量移液器：0.1μL～2.5μL，1μL～10μL，2μL～20μL，10μL～100μL，20μL～200μL，100μL～1000μL。5.2高速冷冻离心机(12000r/min)。5.3涡旋混合器。5.4核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。5.5微滴生成仪。5.6PCR仪。5.7微滴读数系统。6样品7.2.1用移液器（5.1）吸取副溶血性弧菌增菌液1mL，加到1.5mL无菌离心管中，12000r/min离心（5.2）10min，吸弃上清；加入50μLDNA裂解液（4.1），混匀（5.3）后沸水浴5min，12000r/min离心5min。取上清保存于-20℃备用。7.2.2按照GB/T19495.3的规定进行CTAB提取法制备模板DNA（4.1,4.2,4.3,4.4,4.5,4.6,4.7），或使用商业化的DNA提取试剂盒时按照其说明书操作。按照GB/T19495.3的规定，用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计（5.4）260nm和280nm的测定核酸含量，用双蒸水稀释至1ng/μL～100ng/μL备用。2DB22/T2911—2018表1微滴数字PCR反应体系体积µL101试剂成分2×ddPCR预混液(4.8)上游引物（10µmol/L）（4.9）下游引物(10µmol/L）（4.9）探针(10µmol/L）（4.9）模板DNA（1ng/μL~100ng/μL）双蒸水1152注1：空白对照实验时，用双蒸水替代样品DNA。注2：阴性对照实验时，用非目标源性成分替代样品DNA。注3：阳性对照实验时(4.10)，用副溶血性弧菌阳性成分DNA。7.5微滴生成利用微滴生成仪完成20µL反应体系的分割（5.5）。7.6PCR反应反应条件：95℃5min，1个循环；95℃15s，60℃1min，40个循环；98℃/10min（1℃/s），12℃保存反应产物。体系完成后，进行数字PCR反应。PCR反应完成后，选择FAM单荧光通道利用微滴读数系统（5.7）进行微滴读数。数字PCR反应的有效分割体系数不得低于理论分割体系数的50%。8.3.1样品扩增终点荧光信号小于阈值，判为阴性，报告未检出副溶血性弧菌。8.3.2样