《铁皮石斛繁育种子袋生产技术规程》编制说明

《铁皮石斛繁育种子袋生产技术规程评定》编制说明一、工作简况（一）任务来源云南大学、广南药王谷生物科技有限公司提出并立项《铁皮石斛繁育种子袋生产技术规程评定》团体标准制定项目，协会负责该团体标准的起草工作。（二）起草单位云南大学、广南药王谷生物科技有限公司、云南山里红生物科技有限公司、云南省地理标志产业协会、云南地标运营产业发展有限公司、地标游学养科技服务（云南）有限公（三）标准主要起草人------------二、制定标准的必要性和意义石斛属（DendrobiumSw.）为兰科（Orchidaceae）第二大属，全世界约有1500～1600种，都为附生植物，主要分布于热带东南亚及大洋洲地区。兰科植物能产生像尘埃一样数量巨大的种子，种子非常细小，没有胚乳，需要依靠特定的菌根真菌提供营养来促进其萌发和幼苗形成，萌发后的生长发育过程中也往往需要依赖与之共生的真菌，只有当真菌与幼苗的根形成共生菌根后，改善了水分和矿质营养的吸收利用，植株才能正常地生长发育。利用菌根真菌来促进种子萌发和获得幼苗，能显著提高幼苗在自然环境中的存活率和生长速度，被认为是濒危兰科植物保护的重要途径。对于药用石斛产业而言，在大棚集约化栽培模式中，通过组织培养技术进行种子无菌萌发生产种苗，人工增施营养，利用农药控制病虫害，在整个生产过程中，菌根真菌的作用被完全忽略，但在自然条件下开展药用石斛的仿野生栽培，利用种子和特定的真菌共生萌发，并制备成真菌袋，不仅能简化种苗生产过程，丰富种植场景，降低生产成本，更重要的是能有效地促进幼苗的生长和增强抗逆性，提高产品品质，缩短生产周期，具有巨大的应用价“真菌-种子袋”是一种专门为铁皮石斛种子在野外进行直播而设计的繁殖材料，通过将显著促进铁皮石斛种子萌发及幼苗建成的特定真菌菌粉、铁皮石斛种子以及水苔等按照特定配比混合制成，解决了兰科植物种子在自然条件下萌发和幼苗形成的问题，对于以收获植株茎干为目的药用铁皮石斛仿野生栽培来说，是铁皮石斛仿野生栽培技术的革命性突破。目前已利用“真菌-种子袋”技术开展仿野生栽培技术示范和推广，初步形成了铁皮石斛仿野生栽培产业，促进农民增收和区域经济发展，具有显著的社会效益和经济效三、主要起草过程组建了包含云南大学、广南药王谷生物科技有限公司、云南山里红生物科技有限公司、云南地标运营产业发展有限公司、地标游学养科技服务（云南）有限公司的企业代表以及云南省地理标志产业协会内部专家的标准起草组。本项目立项后，标准起草组通过调研、收集资料、分析研究起草了标准讨论稿，由协会专家库随机抽取专家，经多次讨论修改、召开研讨会、听取意见建议修改后形成了征求意见稿及编制说明。征求意见稿及编制说明形成后，在省、州市级行政管理部门、相关研究机构和地理标志产品相关产业的企业进行了广泛的征求意见。共提出意见15个，标准起草单位或工作组对意见处理结果：采纳13个，因其中一个专家建议删除其中条款，所以未采纳另一个专家对该条款的内容修改。经过对相关反馈意见进行分析研究和处理，对标准征求意见稿进行修改完善，形成《铁皮石斛繁育种子袋生产技术规程》团体标准草案。四、编制的原则和依据，与现行法律、法规、标准的关系1、合规性原则标准起草要完全按照国家相关法律法规和产业政策标准的规定。2、可行性原则标准内容和要求要具有可行性、适用性和可操作性。3、规范性原则编写内容与格式严格按照按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规（二）依据国家/省市相关法律法规、产业政策的规定和铁皮石斛的研发、栽培、管理、采收和溯源管理等实际情况。五、标准主要条款的说明（一）真菌-种子袋Fungus-seedbags真菌-种子袋是一种专门为铁皮石斛种子在野外进行直播而设计的繁殖材料，通过将显著促进铁皮石斛种子萌发及幼苗建成的特定真菌菌粉、铁皮石斛种子以及水苔等按照一定的配比混合制成。（二）茶包袋透气、易降解的纸质茶包袋（长*宽：6.2*5.5cm）。（三）菌株菌株为从铁皮石斛自然萌发的原球茎中分离获得的菌体，该菌株通过形态和分子序列研究，为蜡壳耳科的一个真菌新种，定名为石斛蜡壳菌（SerendipitaofficinaleX.J.Wang），菌株在GenBank登录号：MN173026；在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为：CCTCCNo:M2019744。（四）菌株活化利用接种环，从试管斜面中取出一小块石斛蜡壳菌（SerendipitaofficinaleX.J.Wang）菌种，将菌块置于平板中心，该平板预先准备好马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA；马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L,琼脂20g/L，pH=5.8-6）；用封口膜将平板密封，放置在25±2℃的培养室中进行暗培养，约10天，待真菌菌丝长满培养基表面，即可将其作为后续的接种物。（四）培养基培养基为马铃薯葡萄糖液体培养基（PDB；配方：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L,pH=5.8-6）。分装300ml培养基至锥形瓶（500ml）中，用锡箔纸密封好瓶口，然后将装有培养基的锥形瓶放入高压灭菌锅中，设定条件为121℃下灭菌20分钟。灭菌完成后，将培养基转移到超净工作台上冷却至室温。（五）真菌扩繁在超净工作台上，使用已灭菌的尖镊切取步骤4.2.2中预备的液体培养基中。接菌操作完成后，立即用锡箔纸密封定。将含有培养基和菌块的锥形瓶放置于振荡培养箱中，启动仪器进行振荡培养（25℃±2℃,200转/分），以促进真菌的孵化扩繁。培养15天左右，菌丝就能长满；冬季，可能需要延长培养时间至大约20天，以确保菌丝生长充分。（六）菌粉配制利用尼龙网过滤步骤4.2.4中得到的含有培养基和菌丝的混合液，以分离出菌丝。移除溶液，仅保留菌丝，并使其自然沥干，得到纯净的菌丝。将纯菌丝与琼脂以1:2的重量比混合，放入多功能粉碎机中，先进行4秒的快速粉碎，然后暂停机器，等待仪器完全停止，打开盖子，用干净玻璃棒进行搅拌，确保菌丝充分粉碎，再次启动粉碎机进行3秒的粉碎，以获得粒径均匀的菌粉。将得到的菌粉倒入不锈钢托盘中，摊平、不超过1厘米的厚度。将托盘放入电热恒温鼓风干燥箱中，在28℃的温度下吹风烘干24-36小时（期间适当搅拌菌粉，确保菌粉充分干燥）。（七）铁皮石斛种子活力检验铁皮石斛种子使用前，先使用TTC（2,3,5-氯化三苯基以上，备用。具体方法见附录A。（八）萌发率检测试验之后，使用高压灭菌锅对其进行灭菌处理，确保松树皮的无菌状态。冷却后，将松树皮均匀地铺（厚度：2-3cm）到塑料饭盒中。手动将铁皮石斛真菌-种子袋中的粉末抖均匀，并用干净水源充分浸泡（浸泡5-10分钟直至湿透。将湿润的真菌-种子袋放置于松树皮基质上，紧接着盖上饭盒盖。最后将塑料饭盒放置在组织培养室内（25℃±2℃,光照周期：12/12h光/暗，光照强度：2000lx）中进行共生萌发培养。（九）萌发率评估共生萌发培养30天后，统计铁皮石斛真菌-种子袋的萌发情况。萌发率（%）=成功萌发袋数/总袋数*100%。（十）菌粉+铁皮石斛种子混合粉末含水率检验菌粉+铁皮石斛种子混合粉末长期贮存要求的含水率与铁皮石斛种子贮存要求的含水率一致，因此统一按照GB/T3543.6的规定进行含水率检验。（十一）真菌-种子袋菌粉量检验使用天平依次称重每袋真菌-种子袋的菌粉重量。（十二）检验结果判定上述报告中若有