土壤中分解尿素尿素的细菌的分离与计数

微生物的培养与应用课题2:土壤中分解尿素的细菌的分离与计数第一页，共三十九页。第二页，共三十九页。一、课题目标

研究培养基对微生物的选择作用，进行微生物数量的测定。

二、课题重点与难点

重点：对土样的选取和选择培养基的配制。难点：对分解尿素的细菌的计数。第三页，共三十九页。三、研究思路

微生物的选择培养，是指利用培养基的组成使适宜生长的特定微生物得到较快繁殖的技术，也称为微生物的“选择培养〞。〔一〕筛选菌株第四页，共三十九页。在本课题提供的选择培养基的配方中，尿素是培养基中的惟一氮源，因此，原那么上只有能够利用尿素的微生物才能够生长。但实际上，微生物的培养是一个非常复杂的问题，有些微生物可以利用其他微生物的代谢产物生长繁殖，因此能够在选择培养基上生长的微生物不一定是所需要的微生物，还需要进一步的验证。第五页，共三十九页。第六页，共三十九页。〔二〕统计菌落数目统计菌落数目的理论依据是：当样品的稀释度足够高时，培养基外表生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。因此，恰当的稀释度是成功地统计菌落数目的关键。为了保证结果准确，通常将几个稀释度下的菌液都涂布在平板上，培养后再选择菌落数在30～300的平板进行计数。第七页，共三十九页。说明设置重复组的重要性。第一位同学只涂布了一个平板，没有设置重复组，因此结果不具有说服力。第二位同学考虑到设置重复组的问题，涂布了3个平板，但是，其中1个平板的计数结果与另2个相差太远，说明在操作过程中可能出现了错误，因此，不能简单地将3个平板的计数值用来求平均值。这个实例启示学生，在设计实验时，一定要涂布至少3个平板，作为重复组，才能增强实验的说服力与准确性。在分析实验结果时，一定要考虑所设置的重复组的结果是否一致，结果不一致，意味着操作有误，需要重新实验。第八页，共三十九页。思考题1.想一想，如何从平板上的菌落数推测出每克样品中的菌落数？答：统计某一稀释度下平板上的菌落数，最好能统计3个平板，计算出平板菌落数的平均值，然后按课本旁栏的公式进行计算。第九页，共三十九页。第十页，共三十九页。

A同学的结果与其他同学不同，可能的解释有两种。一是由于土样不同；二是由于培养基污染或操作失误。〔三〕设置对照究竟是哪个原因，可以通过实验来证明。第十一页，共三十九页。另一种方案：将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少的。实验方案有两种一种方案：可以由其他同学用与A同学一样的土样进行实验，如果结果与A同学一致，那么证明A无误；如果结果不同，那么证明A同学存在操作失误或培养基的配制有问题。第十二页，共三十九页。四、实验案例

实验的具体操作步骤如下:

1.土壤取样

从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。土壤中某样品细菌的别离与计数第十三页，共三十九页。准备牛肉膏蛋白胨培养基和选择培养基将菌液稀释相同的倍数，在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落数目应明显多于选择培养基上的数目，因此，牛肉膏蛋白胨培养基可以作为对照，用来判断选择培养基是否起到了选择作用。由于初次实验，对于稀释的范围没有把握，因此选择了一个较为宽泛的范围：稀释倍数为103～107。每个稀释度下需要3个选择培养基，1个牛肉膏蛋白胨培养基，因此共需要15个选择培养基，5个牛肉膏蛋白胨培养基。此外，还需要准备8个灭菌的试管和1个灭菌的移液管。

2.制备培养基

第十四页，共三十九页。第十五页，共三十九页。将10g土样参加盛有90mL无菌生理盐水的锥形瓶中〔锥形瓶体积为250mL〕，充分摇匀，吸取上清液1mL，转移至盛有9mL的生理盐水的无菌大试管中，依次等比稀释至107稀释度，并按照由107～103稀释度的顺序分别吸取0.1mL进行平板涂布操作。按照浓度从低到高的顺序涂布平板，不必更换移液管。

3.微生物的培养与观察

第十六页，共三十九页。将涂布好的培养皿放在30℃温度下培养。随着培养时间的延长，会有不同的菌落产生。比较牛肉膏培养基和选择培养基中菌落的数量、形态等，并做好记录。挑选选择培养基中不同形态的菌落接入含酚红培养基的斜面中，观察能否产生如课本中图2-10的颜色反响。第十七页，共三十九页。第十八页，共三十九页。第十九页，共三十九页。为什么别离不同的微生物要采用不同的稀释度？测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？答：这是因为土壤中各类微生物的数量〔单位：株/kg〕是不同的，例如在干旱土壤中的上层样本中：好氧及兼性厌氧细菌数约为2185万，放线菌数约为477万，霉菌数约为23.1万。因此，为获得不同类型的微生物，就需要按不同的稀释度进行别离，同时还应当有针对性地提供选择培养的条件。思考题第二十页，共三十九页。4.细菌的计数

当菌落数目稳定时，选取菌落数在30～300的平板进行计数。在同一稀释度下，至少对3个平板进行重复计数，然后求出平均值，并根据平板所对应的稀释度计算出样品中细菌的数目。

第二十一页，共三十九页。第二十二页，共三十九页。关注菌落的形态、大小、边缘、突起、颜色、质地等等，都是区分细菌的重要手段。第二十三页，共三十九页。关注菌落的形态、大小、边缘、突起、颜色、质地等等，都是区分细菌的重要手段。第二十四页，共三十九页。关注菌落的形态、大小、边缘、突起、颜色、质地等等，都是区分细菌的重要手段。第二十五页，共三十九页。关注菌落的形态、大小、边缘、突起、颜色、质地等等，都是区分细菌的重要手段。第二十六页，共三十九页。关注菌落的形态、大小、边缘、突起、颜色、质地等等，都是区分细菌的重要手段。第二十七页，共三十九页。[一]无菌操作1、取土用的小铁铲的盛土样的信封在使用前都需要灭菌。2、应在火焰旁称取土壤。在火焰附近将称好的土样倒入锥形瓶中，塞好棉塞。3、在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁操作。[二]做好标记注明培养基种类、培养日期、平板培养样品的稀释度等。[三]规划时间第二十八页，共三十九页。六、课题成果与评价

〔一〕培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是否筛选出菌落对照的培养皿在培养过程中没有菌落生长，说明培养基没有被杂菌污染。牛肉膏培养基的菌落数目明显大于选择培养基的数目，说明选择培养基已筛选出一些菌落。第二十九页，共三十九页。

伊红—美蓝培养基是鉴别培养基，可以用来检测自来水中的大肠杆菌是否超标，因为的代谢产物与伊红—美蓝结合，使菌落呈深紫色并带有金属光泽，使大肠杆菌的菌落显示出来，并没有促进大肠杆菌的生长和抑制其他微生物的生长。例如：鉴别大肠杆菌培养基第三十页，共三十九页。大肠杆菌呈黑色中心,有或无金属光泽大肠杆菌在伊红美蓝琼脂(EMB)上典型特征

第三十一页，共三十九页。如果学生选取的是同一种土样，统计的结果应该接近。如果结果相差太远，需要进一步分析产生差异的原因。〔二〕样品的稀释操作是否成功如果得到了2个或2个以上菌落数目在30～300的平板，那么说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数。〔三〕重复组的结果是否一致第三十二页，共三十九页。第三十三页，共三十九页。本课题知识小结:第三十四页，共三十九页。七、例题解析

例1．对细菌群体生长规律测定的正确的表述是A．在液体培养基上进行B．至少接种一种细菌C．接种一个细菌D．及时补充消耗的营养物质解析：细菌群体生长规律的测定是人们在一定条件下进行的。这些条件是：一种细菌、恒定容积的培养基，液体培养基、定时测定细菌总数。在这些条件下，才能测定出细菌的生长规律。测定时只能用一种细菌的子细胞群体的变化规律表达微生物的生长；恒定容积是给微生物提供一定的生存环境；液体培养基才能通过样品推测细菌总数。假设接种多种细菌，那么会发生种间斗争而不能测定一种微生物的生长规律。在接种时，要保证一定的接种量。答案：A第三十五页，共三十九页。例2．在微生物群体生长规律的测定中，种内斗争最显著最剧烈的时期是A．调整期B．对数期C．稳定期D．衰亡期解析：种内斗争是一种生态因素。种内斗争反响了种内生物对生存空间和生活资源的争夺。在生活空间充裕，营养充足的时候，种内斗争的程度是比较低的。随着微生物个体数目的增加，每个个体的生存空间越来越少，营养物质也越来越少，每个个体对生存空间和资源的争夺也越来越剧烈，种内斗争就越来越剧烈。由此可知，在稳定期的种内斗争最剧烈。在衰亡期，微生物的数目已经开始减少，pH已经极度不适于微生物的生存，次级代谢产物积累到很高的程度，这时的微生物的生存斗争主要是与无机环境的斗争。答案：C第三十六页，共三十九页。例3．〔2005年江苏〕抗生素作为治疗细菌感染的药物，其高效性和巨大的经济价值使抗生素工业经久不衰。其中青霉素的发现和应用具有划时代的意义。⑴青霉素发酵产生青霉素。青霉菌的新陈代谢类型是，青霉素是青霉菌的代谢产物。⑵在生产和科研中，常选用处于期的青霉菌作为菌种或研究材料，因为此时的青霉菌代谢旺盛，和比较稳定。⑶对青霉菌菌体生长情况的测定：取一定体积的发酵液，经离心别离、反复洗涤后，，再计算发酵罐中菌体的总重量。异养需氧型次级对数个体的形态生理特性称菌体的湿重〔称烘干后的重量〕第三十七页，共三十九页。解析：青霉菌属于真菌，其代谢类型应为异养需氧型，