大肠杆菌的培养与分离

实验1.

大肠杆菌的培养与别离5/31/20251苍南中学许允文第一页，共二十一页。微生物病毒细菌放线菌真菌原生生物原核细胞真核细胞非细胞结构特点：结构简单,形体微小.通常要用光学显微镜或电子显微镜才能看到，有的甚至没有细胞结构.一、根底知识:1.微生物的种类:5/31/20252苍南中学许允文第二页，共二十一页。关于大肠杆菌:革兰氏染色：代谢类型：主要分布：危害：应用：革兰氏阴性菌〔不着色〕异养兼性厌氧型肠道一般无害，少数有害是基因工程中的主要受体菌之一2核糖体1阅读P18-195/31/20253苍南中学许允文第三页，共二十一页。2.微生物的培养:1)培养基的营养成分:2)培养基的种类:碳源氮源水分无机盐生长因子按物理性质分液体培养基:扩大培养固体培养基:别离、鉴定、纯化按功能分普通培养基：选择培养基：筛选鉴别培养基：鉴定含氨卞青霉素的培养基伊红——美蓝培养基5/31/20254苍南中学许允文第四页，共二十一页。3.细菌的别离:原理:不同的细胞具有不同的菌落特征;有些微生物对抗生素、高盐等具有抗性的特点。方法:划线法、涂布法选择培养基培养5/31/20255苍南中学许允文第五页，共二十一页。二、大肠杆菌的培养与别离实验目的:1、进行大肠杆菌的扩增，利用______培养基进行细菌培养操作。2、进行大肠杆菌的别离，利用______培养基进行细菌的划线培养。3、说明大肠杆菌培养的条件和操作要求的原理。液体固体5/31/20256苍南中学许允文第六页，共二十一页。一、配制培养基，调整pH并灭菌，倒平板备用。按一定营养比例配制培养基+琼脂，融化调整pH灭菌倒平板、搁斜面细菌:中性偏碱霉菌:中性偏酸1、放走冷空气；2、灭菌锅压力与大气压相同时才能翻开。5/31/20257苍南中学许允文第七页，共二十一页。倒平板、搁置斜面待培养基冷却到50℃左右时，在酒精灯附近倒平板。凝固后，倒置放置思考：如何鉴定灭菌是否彻底？放入培养箱中，2d后观察平板是否有菌落生成5/31/20258苍南中学许允文第八页，共二十一页。二、接种、扩大培养1、扩大培养所用的培养基是？2、接种的场所是？3、为何要等接种环冷却后，再取菌体？5/31/20259苍南中学许允文第九页，共二十一页。三、划线别离1、第2、3、4级划线前是否都要对接种环进行灭菌？2、下级划线开始于上一级划线的起始端还是末端？5/31/202510苍南中学许允文第十页，共二十一页。5/31/202511苍南中学许允文第十一页，共二十一页。四、培养将接种后的培养皿放入恒温箱内，在37℃下倒置培养12-24h。平板稀释涂布法平板划线法5/31/202512苍南中学许允文第十二页，共二十一页。平板划线别离法用途：一般多用于从菌种的纯化；

优点：可以观察菌落特征，对混合菌进行别离；

缺点：不能计数稀释涂布平板法用途：一般多用于筛选菌株。一般用于平板培养基的回收率计数。

优点：可以计数，可以观察菌落特征。

缺点：吸收量较少，较麻烦，平板不枯燥效果不好，容易蔓延。如果菌液密度大的话，长不出单菌落。

5/31/202513苍南中学许允文第十三页，共二十一页。五、纯化与保存1、如何进一步纯化菌种？2、如何保存菌种？5/31/202514苍南中学许允文第十四页，共二十一页。1.培养基灭菌后，需要冷却到50℃左右时，才能用来倒平板。你用什么方法来估计培养基的温度？问题讨论答：可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。5/31/202515苍南中学许允文第十五页，共二十一页。3.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？4.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿壁的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？答：可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成菌落的细菌随水而扩散，得不到单细胞菌落；防止杂菌污染。答：空气中的微生物可能在皿盖与皿壁的培养基上滋生而造成污染，因此最好不要用这个平板培养微生物。5/31/202516苍南中学许允文第十六页，共二十一页。5.如何操作才可以尽量防止被杂菌污染？6.在培养后如何判断是否有杂菌污染？7.实验完成后，接触过细菌的器皿应如何处理？操作快捷,减少操作时间;灭菌要彻底,降低环境污染几率;注意微生物生长条件,如pH、渗透压、温度等。是否有不同形态的菌落；用显微镜镜检细胞、孢子、芽孢等形态。高压蒸气灭菌5/31/202517苍南中学许允文第十七页，共二十一页。8、转基因用的质粒通常参加了如抗氨苄青霉素基因。转基因质粒转化进入大肠杆菌后，能在含有氨苄青霉素的培养基中生长，而未被转化的就不能生长，其他没有抗氨苄青霉素基因的杂菌与不能生长。如何别离转基因工程菌，并保证不被普通的大肠杆菌污染？将菌种接种在含氨苄青霉素的培养基中培养。5/31/202518苍南中学许允文第十八页，共二十一页。1、高压蒸气灭菌2、灼烧灭菌3、紫外线灭菌4、过滤〔去除杂菌〕思考：灭菌与消毒有何区别？灭菌的方法：消毒：利用化学或物理方法，杀死大部份致病微生物的过程。灭菌:以化学剂或物理方法消灭所有微生物，包括所有细菌的繁殖体、芽孢、霉菌及病毒，而到达完全无菌之过程。5/31/202519苍南中学许允文